最新更新主题

月度关注热点

【求助】western过程中困扰了我两个月的问题

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2014-5-20 11:19    作者: newway    来源: 分析测试百科网

查看完整版本请点击这里：
【求助】western过程中困扰了我两个月的问题

我最近遇到问题，请指教
我要检测两个同一家族的蛋白Ａ和Ｂ．12％SDS-PAGE，胶1.5mm，RIPA裂解细胞提蛋白；marker使用上海生化所的14kD~96kD粉剂，使用RIPA溶解．总蛋白和marker均用INVITROGEN的loading buffer．35mA/45mA跑胶，跑的很平直，溴酚蓝带很窄．350mA湿法转90min，transfer buffer采用 Na2CO3,NaHCO3,METHANOL(200mL/Per L.)．丽春红染色marker和蛋白都清晰，marker大小位置关系和使用说明上的一致．Ａ，Ｂ分别采用博士德和Santa的两种多抗，二抗北京中杉金桥．结果显示，膜背景干净，条带单一，存在显著的时效量效关系．但，Ａ和Ｂ出现的条带和实际分子量相差10kD以上．曾更换过不同的marker，变更过marker的上样泳道，结果问题依然存在．望指教，为什么ＡＢ的位置始终不正常？
查看完整版本请点击这里：
【求助】western过程中困扰了我两个月的问题

我也来说两句 查看全部回复

最新回复

  • yhz1973 (2014-5-20 11:20:31)

    是大了还是小了？若大了会否是蛋白前体，不同修饰程度？若小了会否降解了？
    还有分子量是否在线性范围内？能否把图贴上来看一下？
    信息不是很全，供参考！
    祝好运！

  • newway (2014-5-20 11:20:52)


    都是变大的.
    但蛋白前体倒是没有考虑过.AB是膜通道蛋白,都可以形成多聚体.
    我认为我们的提取条件不应该打不开这种多聚体.
    分子量是在线形范围内.

  • yhz1973 (2014-5-20 11:22:21)

    也许多聚体可以打开，但是如果是带有信号肽之类的，还没有切掉，不知有没有可能？
    因为你的方法应该是提总蛋白，包括胞内部分，能否只提膜蛋白（当然，难度要大得多）
    另外再查查文献，看看有没有类似的文章
    祝好运！

  • newway (2014-5-20 11:22:45)


    类似的文章的结果都正常,我所用的提取方法其实也是参照文献中的.信号肽一般都没有大的吧,真是难于理解.

  • taoshengyijiu (2014-5-20 11:23:09)


    How do you count the molecular weight of your protein? Have you taken glycoslation into acount? It is probably because of glycoslation modification.

  • newway (2014-5-20 11:23:35)

    有人说糖基化会使蛋白WESTERN 结果出现SMEAR.可是我的情况中没有这种现象.我对糖修饰确实了解不多,在我所看的文献中也没有说到它们会糖基化.再有就是, 请问假如糖基化会使蛋白分子量改变10KD以上吗?谢谢

  • newway (2014-5-20 11:24:15)

    有没有做CONNEXIN 的同行? 盼望能给我点提示

  • taoshengyijiu (2014-5-20 11:24:45)


    假如糖基化会使蛋白分子量改变10KD以上吗?"
    It is absolutely possible that glycoslation modification increase your protein molecular weight over than 10kd. Usually MW of your protein will increase 1-3kd by one additon of glycoslation modification site. You can predict it by use of some software. Also you can identify it by some trials that can detect glycoslation.

  • ending (2014-5-20 11:25:06)

    变性不充分

  • newway (2014-5-20 11:25:38)

    楼上战友所说变性不充分,我想即便是变性不充分也有可能检测到一点变性的蛋白吧, 但片子上只有单一的条带.我用的loading buffer是invitrogen 公司的产品,说明书上要求70度加热10分钟,我按照这个条件去操作的,而且我还另加了DTT,所以我认为我的变性条件应该是可以的了.分子克隆上的2*SDS loading buffer我们也试过,蛋白提取出来后90度变性了10分钟以上，出来的条带大小也是错的.
    " Also you can identify it by some trials that can detect glycoslation."
    因为我对糖基化修饰很不熟悉,所以还请if888介绍一下预测分析的软件,这种软件的结果可信吗,糖基化修饰位点的预测会不会象是磷酸化位点的预测一样过于理想化?
    另外,象我们这种情况的糖基化检测应该用什么好,怎么去单独检测我们目的蛋白的糖基化?或者有没有什么简单的方法可以把总蛋白进行去糖基化的?
查看全部回复 我也来说两句
查看完整回复请点击这里：
【求助】western过程中困扰了我两个月的问题