【求助】包涵体表达后的电泳检测

最新回复

• bamboo16 (2014-5-20 13:36:21)

  1 取1 ml菌液，离心，弃上清。
  2 加入适量PBS，超声波破碎，或者溶菌酶裂解细胞。
  3 5000转（3000G）离心15分钟，分别取上清和沉淀。
  4 上清与沉淀分别用5×SDS loading buffer处理，上样电泳。
  5 如果上清中没有你的目的条带，那么你的蛋白可能是主要以包涵体形式存在。

• one (2014-5-20 13:36:42)

  
  不好意思，我不知道什么是pre-cast的胶，我们这都是走普通的SDS-PAGE胶。前些日子都在做包涵体，我们只取300 ul左右菌液，离心去上清，加20 ul2×SDS loading buffer、20水，煮样5分钟后取20 ul上样，电泳。

• misswu61 (2014-5-20 13:37:01)

  不用离心，直接取菌体电泳对吧？
  Pre-cast胶就是买人家做好的胶，比较贵而已
  等做出结果来再更改标题，再次感谢！

• flower-201 (2014-5-20 13:37:19)

  细菌表达的可溶性蛋白是分泌在细胞壁与细胞膜之间，而包涵体是分泌在细胞浆中的不溶于水的颗粒状物体，蛋白没有形成正确的折叠。蛋白不管是何种表达，蛋白都是在菌体中，收集菌体，煮沸可以看出蛋白是否表达。如果有表达。我们会用netjuzi的方法进一步鉴定蛋白的表达方式。

• 耗子=== (2014-5-20 13:37:56)

  
  很想问问大家，1ml菌液液可以超声吗？那是不是要很小的探头啊？

• huifeng0516 (2014-5-20 13:38:18)

  
  楼主，你的蛋白是包涵体表达，那你用的是什么载体啊？

• ukonptp (2014-5-20 13:38:44)

  很想问问大家，1ml菌液液可以超声吗？那是不是要很小的探头啊？
  
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  是的，没有可以用溶菌酶，要方便的多，而且可重复性好。

• misswu61 (2014-5-20 13:39:10)

  disaster...
  I send the primer sequence to the technician in the lab, followed by her sending to purchase office in the colledge. The officer made a mistake for deleting a nucleic acid which resulting in a frame shift...Then the frame does not contain a stop codon...
  That is, at least, one of the reasons for the failure

• misswu61 (2014-5-20 13:39:28)

  楼主，你的蛋白是包涵体表达，那你用的是什么载体啊？
  
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  pET22b. Any suggestion? Thanks

• misswu61 (2014-5-20 13:39:46)

  I should be more careful to check the sequence when I get the pachage other than just to check the name and scale...
  Now, I can do nothing but to wait the new shipment. Really a lesson.