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【求助】一个酵母表达蛋白的问题
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失眠
痛苦了很长时间了。
我用酵母菌表达一种蛋白，完了拿培养液上清液进行SDS-PAGE电泳检测
结果除了MARK外，没有其他任何条带，连杂蛋白都没有，有时甚至连MARK
带都看不到为此，极度郁闷，日日思虑到黄昏，夜夜失眠到天明。
各位大哥知道是什么原因吗？谢谢！
我PAGE用的是12%的分离胶和5%的浓缩胶，总分子量约为15KD左右。
我试了用丙酮沉淀浓缩蛋白，但是结果........郁闷啊。。丙酮沉淀我的酵母培养（离心）上清液后，发现管底有一层比较粘稠又油的东西，白色的蛋白浮在这层上面。不知道是什么东西，蛋白提取就很麻烦，电泳结果也没有条带
从头到尾，我一直用的YPDS培养液，我的蛋白是分泌型的，不知道这个有没有问题
郁闷得快哭了
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最新回复
3648755 (2014-5-21 11:01:49)
酵母表达量不高的时候，跑胶是看不到带的，做个western或者银染看看
不过mark也看不到，那就是跑胶出了问题
你做的时候，最好要同时跑个阳性（确认表达）和阴性（为转化的空菌或者诱导前的样品）对照
lixi559 (2014-5-21 11:02:07)
酵母表达量一般不高,大部分都是分泌到培养基表达的。表达的时间段也很长,有的甚至要4天才表达。跑电泳时要浓缩的,要不肯定很能看到有蛋白了,我们实验室一般都是取1ml 的酵母上清表达液加上100微升的丙酮或三氯醋酸,蛋白变性2h或过夜后高速离心,沉淀溶于20-40微升的尿素中去跑SDS-PAGE电泳。不过表达量太低是要做Western或银染去验证的,验证有表达再去优化表达条件呐。
veiwu (2014-5-21 11:02:27)
谢谢
veiwu (2014-5-21 11:03:24)
谢谢！
hold住 (2014-5-21 11:05:16)
酵母表达一般分泌出来的蛋白是不多的，杂蛋白就更少了，跑不出来是很正常的。
建议你做个western，才能确定究竟有没有表达
采用有机溶剂沉淀蛋白质，温度和沉淀时间很重要。但不排除沉淀后得到很多杂质的可能，所以要严格控制低温和比例，常温下有机溶剂可使蛋白质变性，低温条件下可减慢变性速度。因此用有机溶剂沉淀蛋白质时应在低温条件下进行。如利用丙酮沉淀蛋白质时，必须在0～4℃低温下进行，丙酮用量-般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离，否则蛋白质会变性。
沉淀后离心速度一般在12000－16000g，然后复溶，再做SDS-PAGE
yjf1026 (2014-5-21 11:05:40)
veiwu (2014-5-21 11:06:12)
恩。非常感谢！
正在培养，打算按照大哥们的方法做做看。
是蛋白溶液是丙酮的10倍吧？
前面两为大哥的说法不一致....
veiwu (2014-5-21 11:06:32)
实验还是很失败，大哥大姐们还有有什么建议吗？
谢谢了！！
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