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【求助】融合蛋白想直接在亲和柱上做酶切，可行吗？

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2014-5-21 16:00    作者: tieshazhang    来源: 分析测试百科网

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【求助】融合蛋白想直接在亲和柱上做酶切，可行吗？

我在做融合蛋白，需要用肠激酶来切。为了纯化方便，想在NI亲和层析结合了HIS tag之后，先洗杂蛋白，再用肠激酶的裂解buffer来洗几次换一换缓冲液，然后加肠激酶切，切完后目的蛋白应该就在上清液里面。这个方法在invritrogen的his亲和层析的操作手册上有提到过，但没有具体讲。有没有做过这方面的达人可以指导一下呢？
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  • junjie05 (2014-5-21 16:01:29)


    基本上，我做GST的fusion protein时使用过。没有问题。只是我当时没有用管柱，而是用离心管装凝胶。经一系列的wash后，change to cleavage buffer and add enzyme to cleave the fusion protein. When the reaction was done, the target protein will be in the supernatant.
    Hope this will help.

  • orangecake (2014-5-21 16:03:29)

    偶觉得肠激酶好贵啊
    一直不敢取这个酶切点，汗一个

  • tieshazhang (2014-5-21 16:09:48)

    ,请问切的时候需要一直摇晃，保持凝胶呈悬浮状态吗？而且，酶一般加多少量？

  • BUK (2014-5-21 16:10:07)


    不建议使用EK做柱上酶切
    EK酶切条件需要摸索，温度、时间、缓冲液条件、蛋白浓度都需要适宜的条件，否则会出现切不动或者降解蛋白的问题。
    EK酶切时，需要添加2－5mM的Ca离子做激活剂，在捏住上，Ca离子可能被鏊合或者产生沉淀，印象后续的纯化
    凝血酶常常用于GST蛋白的柱上酶切，不过也不容易做出理想的纯度
    还是分步纯化，摸好条件再考虑是否可以做柱上酶切

  • BUK (2014-5-21 16:10:38)

    QUOTE:

    原帖由 tieshazhang 于 2014-5-21 16:09 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
    ,请问切的时候需要一直摇晃，保持凝胶呈悬浮状态吗？而且，酶一般加多少量？
    肠激酶用量，需要根据你的底物蛋白浓度以及EK活性单位的定义来计算

  • tieshazhang (2014-5-21 16:12:03)


    今天少量的试了一下,有结果再上来汇报
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