【求助】请帮忙分析下WB曝光图

字体: 小中大 | 打印发表于: 2014-5-21 17:27 作者: wsll 来源: 分析测试百科网

我的目标蛋白是一个内质网膜蛋白.分子量58KD.
样品处理:先用钙沉淀制微粒体.
SDS-PAGE:loading buffer 用的是DTT,煮10min.因为怕膜蛋白被沉淀下去,上样前未离心.上样量60微克.70V30min,110V70min.
转膜:湿法 180mA.1h.
封闭:5%脱脂奶过夜
一抗:是一个多克隆抗体.1:1500,1h.说明书上写着它还能另外结合一个结构很相近的亚族蛋白,而这两个条带我们都要.(图因扫描技术不好,不是很清楚,最后一道上可以看到有两条很近的带).
二抗:1:3000,1h
ECL显色.曝光30S.
结果条带上面有很深的显影.自己分析一下原因觉得有以下几种可能:
1.没离心,所以样品有后拖.
2.一抗特异性不高.
请问各位,造成这种图的原因可能是什么?
该如何改进呢?

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【求助】请帮忙分析下WB曝光图

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7437654 (2014-5-21 17:28:49)

推荐Tank transfer的时候选择30V-40V过夜转,而封闭的时候选择RT封闭2h.
PCR (2014-5-21 17:29:13)

1.我感觉你的marker怎么隔的那么近呢？marker分别是多大的？
如果允许我觉得可以适当延长电泳时间。
2.曝光时间的问题。可以缩短一下曝光时间。
wsll (2014-5-21 17:29:37)

QUOTE:
原帖由 7437654 于 2014-5-21 17:28 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

推荐Tank transfer的时候选择30V-40V过夜转,而封闭的时候选择RT封闭2h.
谢谢您.
能告诉我这样做的原因吗?
wsll (2014-5-21 17:31:08)

QUOTE:
原帖由 PCR 于 2014-5-21 17:29 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

1.我感觉你的marker怎么隔的那么近呢？marker分别是多大的？
如果允许我觉得可以适当延长电泳时间。
2.曝光时间的问题。可以缩短一下曝光时间。
marker第一条是110左右，第二条是89,第三条是49。用的是10%分离胶。分得开不开与这种结果有关联吗？
wiwi (2014-5-21 17:31:46)

个人意见，仅供参考
我们用的marker一般最大是250的。
你的很小，那就没太大关系了。
另外多谈几个问题。
1.上样量的问题，我们这边的每个泳道最大上样量是20ug。
2.关于抗体特异性的问题。
我也在尝试提取一种膜蛋白。和你的很类似。我们也在尝试各种抗体。
我们买了4-5种商品抗体，结果仅一种可以用于试验，得到了目的带。别的抗体或者出现别的条带，或没有特异条带。
同时我们委托国外公司合成了6种抗体，目前正在测试，只剩了两种还要进一步测试。
3.关于提取蛋白纯化。
我们曾经尝试了一些方法提取这种膜蛋白。得到的结果很不理想。
超高速离心并WGA纯化后可到到较为理想的结果。
4.曝光时间问题。可以选5s ，30s ，1min，尝试不同的曝光时间。
以上你仅可作为参考，毕竟我们取的不是一种蛋白。
建议，
1一次可以多尝试几种抗体。
2根据文献，寻找合适的较好纯化方法。
dog002 (2014-5-21 17:32:13)

上样量太大了，样品处理也有问题，有脱尾
wsll (2014-5-21 17:32:42)

QUOTE:
原帖由 dog002 于 2014-5-21 17:32 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
上样量太大了，样品处理也有问题，有脱尾
样品处理问题在哪?
拖尾是因为上样量太大造成的吗?
ququer787 (2014-5-21 17:33:04)

本人认为蛋白没有完全溶解，loading的量也太多了。