【求助】蛋白纯化反相柱选择问题

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• bamboo16 (2014-5-22 09:52:50)

  
  HP-RPC的选择首先要看蛋白质的分子量，20kDa左右的一般用C4或C8，再小一点的可以用C18，太大的蛋白并不适于反相分离。C18通用性最好，但是有时候保留过强可能会导致收率较低。如果目的蛋白不是很针对，可以考虑通用性最强的C18柱。
  一般来说，4.6mm的内径比较常见，250mm长的柱子比150mm的柱子分离度要好，无论对小肽还是蛋白都是这样。
  其次要注意填料的孔径，80A左右的填料主要是用于小分子的分析分离，对于蛋白这样的大分子，要用300A孔径的填料，可以避免分子扩散到填料内部的摩擦阻力，提高柱效。此外C载量来说，蛋白柱和一般的C18也是不一样的。
  Agilent, Waters，Vydac都有相关的成熟产品，最好能配备相应的保护柱。
  更小内径的柱子可以节省流动相，有些更适于甲酸等液质连用的情况。
  制备的话，还是考虑聚合物的制备级填料Source RPC比较好，可以NaOH CIP。Amersham也有ReSource的聚合物反相分析柱卖，寿命会长些，该柱非极性与C8相近，但是价格较贵，印象中要RMB 8000。
  一般的进口柱连同保护柱，RMB4000差不多搞定了。

• tianmei001 (2014-5-22 09:53:21)

  
  我以有一根Agilent的从从c18柱，是用来作液相分析有机物的，不知道可不可以代用
  另外，如果是比较大的蛋白，几十kD 看来就不适合作反相了，那有什么分辨率高的柱子吗

• bamboo16 (2014-5-22 09:53:42)

  
  你查一下说明书，看看孔径是多少？
  80A的不大适合做蛋白，300A的SB-C18才好。
  不过也可以先试试，弄不好可以分开呢，最好有保护柱
  HP-SEC用的也比较多，Shodex的SEC不错，TSK也有。

• tianmei001 (2014-5-22 09:55:13)

  
  那么你是说，不可能有一根柱子，可以分析所有的蛋白了，总是有分子量的范围了。我看安玛西亚的source RPC说明似乎没有具体说分析分子量范围啊，
  大家能不能给推荐一根啊，便宜点的

• bamboo16 (2014-5-22 09:55:35)

  
  太大分子量的蛋白用Source RPC分离收率也一样不会高的，不过对于硅胶C18系列分析柱，柱子寿命更重要，为了防止堵柱，自然，厂家会强调如何根据蛋白性质来选合适的柱，以尽量延长柱寿命为自己产品赢得口碑。
  对于安马西亚的Source RPC，它的非极性和C8的蛋白柱相近，这一点是明确的，但选择性不同。Source柱可以CIP再生，所以寿命不是问题，就是沉淀了活是洗不下来也不用担心，用浓酸碱再生就是了，所以也用不着强调分子量范围，而只是说和C8的非极性相似。一般的SOURCE RPC的载量是用胰岛素标称的，可见主要用于小蛋白的分离。
  对于C18柱，配合相应的保护柱应该可以适用于大部分的应用，收率可能低，但是有保护柱保护，柱子一般不会坏就是了。一般进口的要RMB4000(including guard cartridge)，TSK不知道有没有，不过TSK的柱质量肯定不如Waters或Agilent/vydac，便宜也便宜不了多少。
  

• bamboo16 (2014-5-22 09:55:56)

  
  哦，谢谢啊，
  安玛西亚的source柱，如果用于大蛋白呢，是不是分不开，还是分离效果差了。一般可以分开多大的蛋白呢，是不是安玛西亚的这种柱子，还可以保留蛋白的活性，而一般的c18。c4的等硅胶柱不可以

• bamboo16 (2014-5-22 09:56:53)

  
  对于分离而言，Source 和C18相比，没有明显的优势；但是前者寿命长，不怕堵塞，压力低，设备会便宜，可以自己填装，容易放大。
  不同的填料和蛋白活性没有直接联系，但是非极性强（保留强）的柱子更容易使蛋白变性，比如C18比C8更容易使蛋白变性，因为蛋白容易变性，有的甚至沉淀，所以对柱子的寿命会有影响，所以能用C8就尽量不要用C18。
  此外维持蛋白活性还可蛋白本身的稳定性和所用的离子对试剂的种类和浓度/分离时间等条件有关，要综合考虑。
  以硅胶反相柱为例，太大的蛋白无法进入小的孔径，无法利用孔径内的配基位点，因此分离效果不会很好，但也不绝对，要看杂蛋白的情况。如果分子量不是太大，那可以试试看再说，最好有保护柱。
  Source柱的非极性和C8相近，一般也足以使蛋白保留了。可以放心的试，不用担心蛋白沉淀对柱的寿命产生影响。
  不知道说清楚没有

• fei1226com (2014-5-22 09:57:15)

  
  请问一下，阁下是否用过silica这种反相介质？如用过能否给小弟一些使用建议，如介质用过后如何处理等等。

• bamboo16 (2014-5-22 09:57:35)

  常见的C8,c18都是硅胶基质的反相填料。这种填料比较耐压，但是pH范围较窄，一般为2~7，以免硅胶水解或配基脱落。
  处理的话看说明书即可，要注意极性和非极性溶液之间的过渡就可以了，一般分析柱不要反冲。
  如果你说的是普通的层析硅胶，那还是属于正相层析，因为硅胶本身是极性的，一般不用于分离蛋白。同样也要注意溶液间的置换。

• jujuba (2014-5-22 10:26:14)

  
  请问版主，我现在用的是C18的反相柱， 我是分离水解酶水解的碱基的，样品水解后没有处理，直接进样，用HPLC分离，但是水解的过程中的水解酶是蛋白，一个是碱性磷酸酶，一个是磷酸二脂酶，所以一直担心这些蛋白会不会堵C18 柱。有时候柱压会升高。请指教！