蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】等电聚焦中两性电介质的最佳浓度，其对聚焦...

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 12  1/2 12››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】等电聚焦中两性电介质的最佳浓度，其对聚焦...

junhun[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77185
精华 0
积分 561
帖子 781
信誉分 100
可用分 4746
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-14
状态 离线
1

发表于 2014-5-22 10:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】等电聚焦中两性电介质的最佳浓度，其对聚焦...


请问各位做双向电泳的同门专家：两性电介质在等电聚焦中最佳浓度怎么定量，其浓度差异对聚焦过程有何影响？
我使用过的浓度是PH3-10:0.4%,100ul；PH4-6:0.8%,200ul；PH6-8:0.8%,200ul。
其效果都不太好。
我做的是植物的种子蛋白质。
请赐教！！
顶部
66+77[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75637
精华 1
积分 596
帖子 785
信誉分 103
可用分 4751
专家分 20
阅读权限 255
注册 2011-10-26
状态 离线
2

发表于 2014-5-22 10:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

做双向电泳的两性电介质在等电聚焦中最佳浓度怎么定量，其浓度差异对聚焦过程有何影响？
这个问题其实是早就有人做过相关研究拉,一般来说,加的两性电解质并不是越多越好,加的越多,聚焦中的除盐都非常花时间,升压比较慢，造成样品损失较大(主要是降解和蛋白修饰)。根据我做的经验嘛，一般是加0.2%（W/V）的BIo-lyte电解质（不考虑PH范围影响）。
从理论上说就是你的两性电解质不能过多，多了反而不利于你聚焦充分，小分子电荷离子多了，在你的IPG条里面乱串。
分析你的原因应该是你的样品处理需要进一步的优化，至于你怎么来优化，我就不知道你的样品是什么？怎么处理而来的拉？
顶部
junhun[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77185
精华 0
积分 561
帖子 781
信誉分 100
可用分 4746
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-14
状态 离线
3

发表于 2014-5-22 10:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢指教！！
就是说我加的电介质太多？
我做的IEF胶条和样品裂解液都是按照10ml体积来配制的。按照0.2％（W/V）浓度的电介质来算就是加50ul左右啦！！这样的话是不是起始电流就非常的低啊？
而按照我做的浓度：PH3-10:0.4%,100ul；PH4-6:0.8%,200ul；PH6-8:0.8%,200ul，起始电流会达到2mA。我聚焦结束时也只能降到0.3－0.4mA。
我用的电泳装置是BIO-RAD的Mini-PROTEIN 3Cell。跑的样品是油料作物种子全蛋白。
顶部
junhun[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77185
精华 0
积分 561
帖子 781
信誉分 100
可用分 4746
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-14
状态 离线
4

发表于 2014-5-22 10:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这是我的电泳结果图，请各位专家多多指点赐教！！


查看积分策略说明
附件
2014-5-22 10:44
46887098.jpg (26.24 KB)
 
顶部
bring[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 74282
精华 0
积分 597
帖子 914
信誉分 100
可用分 5326
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-9
状态 离线
5

发表于 2014-5-22 10:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不知你用什么方法提的蛋白，干扰物好象过多
顶部
junhun[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77185
精华 0
积分 561
帖子 781
信誉分 100
可用分 4746
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-14
状态 离线
6

发表于 2014-5-22 10:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我用10％三氯乙酸（丙酮配制，含0.07％2－巯基乙醇）沉淀蛋白质，再分别用冷丙酮和80％的冷丙酮洗涤沉淀各两次。最后用真空抽干机风干，常温。-20度保存。
顶部
junhun[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77185
精华 0
积分 561
帖子 781
信誉分 100
可用分 4746
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-14
状态 离线
7

发表于 2014-5-22 10:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这是我的另一个图片，请指教


查看积分策略说明
附件
2014-5-22 10:48
66736986.jpg (42.13 KB)
 
顶部
ero11[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75131
精华 0
积分 684
帖子 1028
信誉分 100
可用分 5953
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-19
状态 离线
8

发表于 2014-5-22 10:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你的上样量是多少啊?为什么不用银染啊?你的考染胶看样子很多小点都没看到，在分析的时候还是用银染吧。
顶部
junhun[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77185
精华 0
积分 561
帖子 781
信誉分 100
可用分 4746
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-14
状态 离线
9

发表于 2014-5-22 10:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我是按照1mg蛋白干粉/10ul裂解液的方法来溶解的，温预后，离心，取上清进行聚焦。请问楼上的大侠，在离心后还用进行再定量吗？
请问蛋白质的银染色步骤是怎样的啊？麻烦推荐一下吧。
谢谢啦！！
顶部
131415[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 74126
精华 0
积分 565
帖子 789
信誉分 100
可用分 4798
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-6
状态 离线
10

发表于 2014-5-22 10:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1、固定 无水乙醇 100ml
冰醋酸 25ml
加去离子水至 250ml 30min
2、敏化 无水乙醇 75ml
戊二醛（50%w/v）* 0.625ml
硫代硫酸钠 0.5g
醋酸钠 17g
加去离子水至 250ml 30min
3、冲洗 去离子水 250ml 3Ⅹ10min
4、银反应 硝酸银 0.625g
甲醛(37%w/v)* 0.1ml
加去离子水至 250ml 20min
5、冲洗 去离子水 250ml 2Ⅹ1min
6、显色 碳酸钠 6.25g
甲醛(37%w/v)* 0.05ml
加去离子水至 250ml 2-5min
7、终止 EDTA-Na22H2O 3.65g
加去离子水至 250ml 10min
顶部
 12  1/2 12››