【求助】等电聚焦中两性电介质的最佳浓度，其对聚焦...

最新回复

• 66+77 (2014-5-22 10:40:49)

  
  做双向电泳的两性电介质在等电聚焦中最佳浓度怎么定量，其浓度差异对聚焦过程有何影响？
  这个问题其实是早就有人做过相关研究拉,一般来说,加的两性电解质并不是越多越好,加的越多,聚焦中的除盐都非常花时间,升压比较慢，造成样品损失较大(主要是降解和蛋白修饰)。根据我做的经验嘛，一般是加0.2%（W/V）的BIo-lyte电解质（不考虑PH范围影响）。
  从理论上说就是你的两性电解质不能过多，多了反而不利于你聚焦充分，小分子电荷离子多了，在你的IPG条里面乱串。
  分析你的原因应该是你的样品处理需要进一步的优化，至于你怎么来优化，我就不知道你的样品是什么？怎么处理而来的拉？

• junhun (2014-5-22 10:43:02)

  
  谢谢指教！！
  就是说我加的电介质太多？
  我做的IEF胶条和样品裂解液都是按照10ml体积来配制的。按照0.2％（W/V）浓度的电介质来算就是加50ul左右啦！！这样的话是不是起始电流就非常的低啊？
  而按照我做的浓度：PH3-10:0.4%,100ul；PH4-6:0.8%,200ul；PH6-8:0.8%,200ul，起始电流会达到2mA。我聚焦结束时也只能降到0.3－0.4mA。
  我用的电泳装置是BIO-RAD的Mini-PROTEIN 3Cell。跑的样品是油料作物种子全蛋白。

• junhun (2014-5-22 10:43:48)

  
  这是我的电泳结果图，请各位专家多多指点赐教！！

  
  46887098.jpg

• bring (2014-5-22 10:47:09)

  不知你用什么方法提的蛋白，干扰物好象过多

• junhun (2014-5-22 10:47:40)

  
  我用10％三氯乙酸（丙酮配制，含0.07％2－巯基乙醇）沉淀蛋白质，再分别用冷丙酮和80％的冷丙酮洗涤沉淀各两次。最后用真空抽干机风干，常温。-20度保存。

• junhun (2014-5-22 10:48:10)

  这是我的另一个图片，请指教

  
  66736986.jpg

• ero11 (2014-5-22 10:48:41)

  
  你的上样量是多少啊?为什么不用银染啊?你的考染胶看样子很多小点都没看到，在分析的时候还是用银染吧。

• junhun (2014-5-22 10:50:03)

  我是按照1mg蛋白干粉/10ul裂解液的方法来溶解的，温预后，离心，取上清进行聚焦。请问楼上的大侠，在离心后还用进行再定量吗？
  请问蛋白质的银染色步骤是怎样的啊？麻烦推荐一下吧。
  谢谢啦！！

• 131415 (2014-5-22 10:50:26)

  
  1、固定 无水乙醇 100ml
  冰醋酸 25ml
  加去离子水至 250ml 30min
  2、敏化 无水乙醇 75ml
  戊二醛（50%w/v）* 0.625ml
  硫代硫酸钠 0.5g
  醋酸钠 17g
  加去离子水至 250ml 30min
  3、冲洗 去离子水 250ml 3Ⅹ10min
  4、银反应 硝酸银 0.625g
  甲醛(37%w/v)* 0.1ml
  加去离子水至 250ml 20min
  5、冲洗 去离子水 250ml 2Ⅹ1min
  6、显色 碳酸钠 6.25g
  甲醛(37%w/v)* 0.05ml
  加去离子水至 250ml 2-5min
  7、终止 EDTA-Na22H2O 3.65g
  加去离子水至 250ml 10min

• junhun (2014-5-22 10:50:45)

  
  谢谢，楼上的朋友！！！
  请问一下，我上面的电泳图前沿有一水平条带，好像有些蛋白质在条带中没有分开。怎么才能除去前沿条带，把蛋白分开。
  是不是平衡液中2－巯基乙醇用量太多，我是用5％的2－巯基乙醇进行平衡的，在蛋白质裂解液中2－巯基乙醇也是5％。
  请各位大侠指教！！

• junhun (2014-5-22 10:51:51)

  请各位双向电泳方面的专家多给点意见。
  谢谢啦！