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【求助】WB过程中的问题
我做PS单抗WB的时候用3%BSA的PBST溶液封闭,结果背景特别深,ECL显影根本看不清是否有条带,国外有文献说这样可以的(文献作者用的是他们自制的封闭液),但是怎么我的结果跟他简直没法比,重复了多次都是这样,我的试剂(封闭液除外)都和那文献说的一样,操作也一样,是不是封闭液的问题?有没有更好的封闭方法啊,高手请指教【求助】WB过程中的问题
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【求助】WB过程中的问题
字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2014-5-22 15:43 作者: standbyme 来源: 分析测试百科网
最新回复
wmp1234 (2014-5-22 15:43:49)
我们实验室用的封闭液是10%的脱脂牛奶加TBST,不知对你是否会有帮助.
笑弯了腰 (2014-5-22 15:44:19)
10%的脱脂牛奶？5％足够了。
wmp1234 (2014-5-22 15:44:49)
QUOTE:
楼主的问题可能出在蛋白提取的问题上，因为我有个同学试验过，也是因为背景色很高，用10％的BSA封闭过夜，效果依然不好，所以有可能不是封闭的不好，而可能是提的蛋白质量不好，因为转膜没有问题，建议再做一次，控制压片的时间，肉眼看见荧光的话，30s足矣，时间长了背景就深，如果依然出现这种情况，建议重新提取蛋白（最好要改变一下条件）再做，免得浪费宝贵时间，好运。standbyme (2014-5-22 15:53:54)
用5%的脱脂奶粉吧，超市有得买，我用这个做了二年，做了的抗体有7,8种，都很好，你试下吧，用TBST稀释脱脂奶粉。
另外背景深还要考虑其他的因素，比如显影的条件，时间等。
ladyhuahua (2014-5-22 15:54:13)
换封闭液试一下，如果不行就找找其他原因吧。背景深，也有可能是以下原因：一抗浓度过高 、二抗孵育时间过长、洗涤不彻底、曝光时间长 等等。不要只是局限在封闭液问题上。
standbyme (2014-5-22 15:54:31)
非常感谢大家的指点,不过脱脂奶粉里有磷酸化蛋白,做PS抗体的WB是不是有影响?貌似容易产生非特异性条带的,是不是这样啊?
ladyhuahua (2014-5-22 15:54:51)
PS是什么东西，我不了解。
BSA（V部分）和牛奶都含有磷酸化的酪氨酸和生物素，这给解释用特异性磷酸化酪氨酸抗体进行的实验造成一定的混淆，也给亲和素/链霉亲和素检测的应用带来一些问题。还有某些牛奶制品可抑制碱性磷酸酶的活性。
虽然常用的封闭液在多数情况下使用比较令人满意，但是不同的抗原和实验方法需要不同的封闭液，楼主根据这些自己定夺吧。
jkobn (2014-5-22 15:55:08)
建议你将抗体再稀释，延长洗膜时间就可以了，不需要在封闭液上做太多的考虑了，用常用的封闭液就可以了
bluelake (2014-5-22 15:55:41)
PS是什么东西，我不了解。
BSA（V部分）和牛奶都含有磷酸化的酪氨酸和生物素，这给解释用特异性磷酸化酪氨酸抗体进行的实验造成一定的混淆，也给亲和素/链霉亲和素检测的应用带来一些问题。还有某些牛奶制品可抑制碱性磷酸酶的活性。
虽然常用的封闭液在多数情况下使用比较令人满意，但是不同的抗原和实验方法需要不同的封闭液，楼主根据这些自己定夺吧。
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zan,同时补充几句,BSA封闭比non-fat dry milk封闭效果差点，但特异性更好点,如果你的一抗是单抗,推荐用后者,如果是多抗,选择用前者;第二,如果你的develop中用的是HRP偶联的,BSA,TBS-T,PBS-T都没关系,如果是AP偶联的,只好选择BSA+TBS-T.磷酸盐强烈抑制AP;第三、如果背景深,你用的是HRP偶联的,你可以用PBS-T洗涤,PBST洗涤效果比TBS-T更强悍.
wood533 (2014-5-22 15:56:03)
我们用这个，效果也很好。
ACE BLOCK
BLOCK ACE
(BUF029)
Volume / Quantity: 20 x4g
Applications: This product has been reported to work in the following applications. This information is derived from testing within our laboratories, peer-reviewed publications or personal communications from the originators. Please refer to references indicated for further information.
Yes No Not Determined Suggested Working Dilution
ELISA:
Western Blotting:
Block Ace is designed as a high-performance blocking reagent for use in immunological assays such as ELISA and Western blotting. It may also be used for dilution of antibodies and for washing procedures in the above assays.
Block Ace has been shown to have superior performance to 1% BSA in blocking in ELISA assays. In comparison to BSA, Block Ace provides reduced backgrounds and sharper standard curves.
For application as a blocking solution in ELISA assays we recommend using the solution diluted four-fold from the freshly reconstituted solution.
For application as blocking solution in Western Blots we recommend using the solution undiluted.
For washing applications we recommend dilution of the reconstituted solution 10-fold, and adding Tween 20 to a level of 0.05-0.2% v/v.
For use as an antibody diluent we recommend dilution of the reconstituted solution 10-fold.
Reconstitution: Reconstitute each 4g vial in 100 ml distilled water
References: 1. Hara, H. et al. (1990) Enzyme immunoassay for measuring antibodies against skeletal muscle in patients with Myasthenia Gravis. Clin Chem. 36:1967-1969
2. Shinmoto, H. et al. (1988) Production of pentameric hybrid immunoglobulins consisting of IgA and IgM. Agric. Biol. Chem. 52:2653-2654
Storage: Prior to reconstitution store at +4oC. Following reconstitution store at +4oC or at -20oC if preferred.
This product should be stored undiluted.
Storage in frost-free freezers is not recommended.
Shelf Life: Prior to reconstitution, 2 years from date of despatch. After reconstitution, 1 week at 4oC or 1 month at -20oC.
Health And Safety Information: (A full Health and Safety assessment is available upon request)
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