【求助】蛋白质聚丙烯酰胺电泳，未见任何条带

最新回复

• avi317 (2014-5-22 16:04:22)

  
  蛋白水解了？上样量太少

• woshiduiyan (2014-5-22 16:04:46)

  
  谢谢！
  蛋白经过变性的，加样的总体积是30ul ，含蛋白3ug ，上样量少了吗？
  还有没有其他的问题呢？

• avi317 (2014-5-22 16:22:13)

  电泳38小时？这么长时间？

• cj_mondy (2014-5-22 16:22:41)

  
  1.蛋白上样3ug有些少了，你提的蛋白浓度不高吗？
  2.70V电压最多也就跑4-5小时就可以跑到最底下了啊，你怎么跑38小时呢，你现在看到的所谓的“溴酚蓝的指示线”是不是就是大分子量的蛋白？其实一般70-80V跑过积层胶，就可以加大电压，总共2小时左右就可以跑完了。
  3.上样Buffer是不是有问题，用的是几乘的？会不会上样buffer不对导致在电泳前蛋白就大部分丢失？
  4.溴酚蓝染色多久？时间短了染不上，还有脱色也要彻底，否则背景很深可能掩盖了蛋白的条带。

• woshiduiyan (2014-5-22 16:23:10)

  
  谢谢！
  下次加大点浓度；
  是大分子量的蛋白（200kd左右）；
  电压太大听说效果不是很好；
  buffer是2x的；
  染色1小时
  脱色12小时，背景很干净了

• one (2014-5-22 16:23:43)

  
  你跑电泳的时间太长了吧。不知道你的胶是多大的？我们实验室7cm左右的胶跑三小时左右，你缩短时间试试，可能样品都跑没了。

• woshiduiyan (2014-5-22 16:24:17)

  
  我跑的是大槽子 十几厘米的，溴酚蓝还没有跑出去，应该没有全部跑掉吧？

• redbutterfly (2014-5-22 16:25:06)

  
  应该是电泳时间太长了

• fangxiang (2014-5-22 16:27:04)

  
  我感觉可能有以下原因：
  1,样品太少了。小胶板，上样10μl,单一蛋白含1μg就不容易看到了. 你的30μl中含有
  3μg,是不是也有点少了?
  2,脱色时间太长了吧??脱色时间太长可以把条带洗掉.
  3,电压应该可以加大些,电泳一两天会不会把本来就有点少的蛋白扩散地浓度更低呢?

• wu11998866 (2014-5-22 16:27:26)

  
  为什么用那么大的胶？
  3ug的蛋白38h光弥散也看不到了
  最好说一下电泳目的

• yonger (2014-5-22 16:27:43)

  
  如果蛋白质电泳时时间过长的话，在电泳缓冲液中可能会发生弥散现象。

• dog002 (2014-5-22 16:28:18)

  电压70v，电泳38小时,溴酚蓝还没有跑出去?
  这个胶板有多长啊？
  一般来说，70V 38小时大可能出现这种情况吧
  建议核对配胶试剂和溶液

• mamamiya (2014-5-22 16:33:07)

  
  电泳缓冲液的缓冲能力太弱，最有可能的原因是电泳过程中蛋白扩散了。
  电泳时间太长了！

• woshiduiyan (2014-5-22 16:33:39)

  
  谢谢各位指点，我加大浓度在试一下 。

• tuuu2 (2014-5-22 16:33:56)

  
  200kd也用不了跑38h，多大浓度的较啊？
  还有染色时间太短了，在高温下染色脱色可以减少时间。一般60度染色45min到1h，脱色2h（中间换一次脱色液），肯定ok
  我现在都是在微波炉里面煮的，一个小时搞定染色脱色

• tangxin_80 (2014-5-22 16:34:13)

  
  原来用微波炉做染色的人还真不少啊！

• zranqi_1 (2014-5-22 16:34:40)

  上样量少，染色时间似乎也短了