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【求助】westernblot 遇到困难，条带残缺
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最近作western经常遇到条带残缺的问题（如图），虽偶尔有正常结果，但不知问题何在，只得一次次作，直到好运来临才出一个片子，白费很多时间。
曾经考虑转膜时膜与胶间的气泡，压片时膜与胶片气泡的问题，努力使之无气泡，但最终还是发现条带被吃掉一块，痛不欲生。活没少干，但老没结果！郁闷ing!
请师兄们指点一下！
（转膜后丽春红染色未见有残缺条带，每条都是完整的）
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最新回复
biabiade (2014-5-23 16:05:54)
先感谢一下关心此贴的网友！
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ending (2014-5-23 16:06:23)
转膜后丽春红染色未见有残缺条带，每条都是完整的
根据这个考虑可能封闭，一抗二抗孵育时注意膜有时容易紧贴在塑封膜上，应该完全浸没。
vcve (2014-5-23 16:06:42)
（转膜后丽春红染色未见有残缺条带，每条都是完整的）就不用考虑是转膜的问题了。
出现你这种情况
一种可能就象楼上所说，膜紧贴在塑封膜上，完全浸没。
还有一种可能，你的膜稍微有点卷，不平整，这样很容易一边抗体摇不到的。
如果你是把整张膜放在皿里面摇的，你得保证膜的每个部分都能摇到抗体（为了保险起见，我都是宁愿多放到牛奶和抗体。不然得不偿失啊），而且摇床转速不要太快，慢点好
biabiade (2014-5-23 16:06:59)
膜是完全浸在抗体里的（我用parafilm膜折的与膜大小一致的容器，放入膜倒入一抗，室温摇1hour，4度过夜）。郁闷！虽不是每次条带都残缺，但一直不知问题在哪。还有其他可能吗？
是不是膜的质量不好？我用的膜是以前人留下的，一大卷，据说NC膜廷贵，我那卷不像值钱的样。
显影液发黑了，会有影响吗？谢谢
fei1226com (2014-5-23 16:07:21)
QUOTE:
显影液发黑, 会有影响, 换新的吧。
蛋白变性后，离心，充分混匀，上样加在孔的中央，排除上样的影响。
biabiade (2014-5-23 16:07:49)
今天又作了，丽春染色如图
压片子还是不行，条带残缺，仅出来几个条带，是不是ECL不行了？
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biabiade (2014-5-23 16:17:43)
要开题了，就指望有点像样的结果。烦ing
3N4G (2014-5-23 16:18:09)
换显色液把，要不就加长显色时间
eve_49 (2014-5-23 16:18:30)
我也遇到同样的问题 究竟是什么原因 大家来讨论讨论阿
68943512yao (2014-5-23 16:19:05)
我可以确定的告诉楼主出现这样的结果是ECL的问题.
但我所指的ECL的问题并不是ECL本身的问题,而是ECL与膜反应不均的问题.
这样的问题我以前经常遇到,有时候显影出来条带残缺,于是我就再加ECL再进行显影,那时候条带就全了.你可以试试. 所以ECL与膜反应必须充分,且显影时最好把膜上的ECL吸干(膜的反面贴在吸水纸上使得膜正面的ECL液被吸掉,肉眼看不到液体就可以,不能太干)
由于你丽春红染色时条带是完整的,所以不可能是转膜的问题.而你说你一抗二抗若没加好一般不会出现像你图中那样的残缺.
希望你能有好的结果.
biabiade (2014-5-23 16:19:36)
请问为什么要把膜上的ECL吸掉？我不太明白，不吸掉会有什么后果？我没吸是不是导致结果不好的原因？
feima+ (2014-5-23 16:19:57)
QUOTE:
ECL不好的话会出现这个问题,我也曾经出现过这种情况, 在对内参照进行显色的时候,发现一个标本的actin 出的不完全, 条带残缺,马上加了显色液再作用片刻,就OK了,条带比较全了.我一般是把膜放在显色液中作用2分钟, 用镊子夹取膜在洗膜的容器边缘除去多余液体,然后马上显影.
个人感觉只要显色液在膜上分布比较均匀就没问题.
any333 (2014-5-23 16:24:16)
非常关注此帖，也祝楼主好运，请问丽春红染色染的是膜吗？目的是看转膜效果吗？如果膜经过丽春红染色再做免疫印迹时丽春红有影响吗？问题很弱智，还望告知，谢谢 。
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