【求助】帮我分析一下我的Western blot结果图

最新回复

• youreyes (2014-5-23 16:26:57)

  
  还有一次的结果是这样的，Western blot的条件都差不多的。

  
  27350048.jpg

• TAT (2014-5-23 16:27:31)

  电泳跑的一般(或者转膜有问题),抗体浓度过高(一抗)

• yonger (2014-5-23 16:28:05)

  可能是转膜的问题，但是转之前是赶过气泡的，不知道问题出在哪里。而且转膜后的胶考染是很正常的，没有像Western那样的扭曲条带。

• windy+++ (2014-5-23 16:28:28)

  
  我们转膜用的都是恒流啊 350mA 90MIN 你可以试一下·！

• remenb (2014-5-23 16:30:08)

  可能的原因
  1,跑胶有问题,胶做的密度不均匀,或者有气泡
  2,转膜不好,刚好那个位置有个气泡或者膜和胶靠的不够紧密.
  不过感觉还是第一个原因

• yonger (2014-5-23 16:30:30)

  
  我们此前作的其他蛋白效果挺好的，就这几天始终有这个问题，我们也怀疑过气泡，但是大气泡是不可能的，所以这样的成片紊乱的情况还是不好解释。有人说可能是我们用的膜太长的缘故，不知道这有道理没有？膜长了，可能与胶贴不牢？

• remenb (2014-5-23 16:30:52)

  
  罕见病例，昨天一发帖我就想置顶哈，不过地方不多了，已经置顶了一个类似贴子，根据版规，除非ubior申请热心战友哈
  我做过十几厘米的半干转，胶和滤纸都是可轻度变形的，贴不牢的可能性不大。根据所述，重点怀疑转膜的问题。ubior还是详细叙述一下转膜的全部操作吧，尤其注意膜的平衡、污染，有无短路存在。
  要是有丽春红染一下，可以确诊是转膜的问题还是显影问题。

• nn255 (2014-5-23 16:32:01)

  
  转膜有气泡，或是夹的不紧或是不均匀

• yonger (2014-5-23 16:32:30)

  
  谢谢大家的支持与帮助。
  膜和滤纸均在电转液里平衡15min，用玻棒赶出气泡，每次都加电转液进行赶，然后进行100V，1.5h。我们用丽春红染色看到膜的确有一大片被模糊染色，也有未染上的一小片，用烤染也一样，但是同时做的另一块膜（另一种样品，膜小一点）结果未出现这种现象。我考虑可能还是转膜的问题，但是就是不明白原因所在。

• yonger (2014-5-23 16:33:22)

  电泳跑的一般(或者转膜有问题),抗体浓度过高(一抗)
  
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  我们的胶经考染后条带非常清楚，没有任何异常现象。抗体浓度经过反复调试没有问题。而电转的问题是肯定的，因为对转后的膜进行染色，发现就是有问题的。所以可以肯定是这个问题。我们的电转步骤是，一层厚滤纸，一层薄的普通滤纸，NC膜，转前均在电转液中平衡15min，用玻棒赶气泡，然后上槽电转。和以前的步骤一样，都做几个月多了。不知道有什么问题。

• yonger (2014-5-23 16:33:41)

  
  我们用的是湿转，仪器应该有几年了，其中有一个夹子中间塑料的连接部位断了，不知道这样会不会造成膜夹得不紧，而出现上述问题。
  今天又重复了一次Western blot，这次是用恒流转的，用的电流强度是（膜面积乘以2）mA,转了3个小时，分别用两个夹子转了两块膜，其中坏的那个夹子的膜经丽春红染色后发现有没有转好，条带是扭曲的，郁闷啊。 是不是夹子的原因呢？

• yonger (2014-5-23 16:34:11)

  谢谢大家的支持与帮助。
  膜和滤纸均在电转液里平衡15min，用玻棒赶出气泡，每次都加电转液进行赶，然后进行100V，1.5h。我们用丽春红染色看到膜的确有一大片被模糊染色，也有未染上的一小片，用烤染也一样，但是同时做的另一块膜（另一种样品，膜小一点）结果未出现这种现象。我考虑可能还是转膜的问题，但是就是不明白原因所在。
  
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  呵呵,定是夹子的问题了!
  一块是好的,一块是歪扭的
  楼主看看,是不是歪扭的每次都用那个坏夹子啊?!

• yonger (2014-5-23 16:34:30)

  
  以前没有注意，今天下午一看膜染色的结果不好，立马又重新跑了电泳，现在正在转膜当中，这次用了好的夹子，过一会看结果了。确定一下是不是夹子的问题了。
  只是很奇怪，这个夹子坏了有一阵子了，以前怎么就能转好呢？

• yonger (2014-5-23 16:34:51)

  
  今天又重复了一次实验，用好的夹子转膜后丽春红染色，条带转的很好，看来确实是夹子松动造成的。感谢这么多天来大家对这一话题的关注，也希望我所碰到的问题能给大家的实验带来一点启发。