【求助】DTT对蛋白电泳的影响？

最新回复

• zsxan1990 (2014-5-23 17:17:51)

  
  在变性电泳中，蛋白质必须经过充分变性才能体现比较真实的分子量。蛋白质的变性需要3个因素共同起作用，100 degree加热打开蛋白链，DTT等还原剂辅助打开二硫键使蛋白质完全呈线形，SDS使线形的蛋白质全部带上负电荷，这样蛋白质在电泳的时候才会有一致的迁移率。缺少了DTT，蛋白质不能完全变形，迁移率当然会发生改变。

• zsxan1990 (2014-5-23 17:18:21)

  更正一处
  最后一句“变形”应为“变性”

• mamamiya (2014-5-23 17:18:47)

  
  我的试验中，上样buffer中用DTT和二巯基乙醇是不一样的，你可以试试二巯基乙醇的上样缓冲液

• ritou1985 (2014-5-23 17:19:53)

  
  我做过的一种蛋白，它可以依靠二硫键形成同源二聚体，这种蛋白本来是50 kD左右，可以形成100kD左右的二聚体。上样buffer我分两种（加DTT和不加DTT），我的同一个样品分别用这两种上样buffer，跑完后胶后加DTT的蛋白的带为50 kD，而不加DTT的为100kD。这是DTT破坏了同源二聚体之间的二硫键所致。
  不过看MmpRS的蛋白两条带的大小不像是由于这种原因，并且跟我的正好相反（加DTT的蛋白的带应该小）。难道正如站友所说?（我本以为一种蛋白内部的二硫键被打开跟没被打开跑出的带应该一样大）。但是站友没有说出到底哪种情况蛋白跑得快？与MmpRS的结果是否一致？

• am10 (2014-5-23 17:20:19)

  
  谢谢大家，我猜测的和楼上说的差不多：不加DTT的时候由于二硫键没有破坏，蛋白折叠的比较紧密，所以分子量偏小，这点可以理解，但是不加DTT后，分子量偏低的蛋白居然由2条变1条，这让我很苦恼，不知大家还有何高见。
  谢谢！

• yapuyapu (2014-5-23 17:23:53)

  楼主是在同一块胶同时进行还原型（含DTT）和非还原型（不含DTT）SDS电泳，大家都知道DTT存在可以打开二硫键（包括亚基间和亚基内的），不过我也有疑问：
  1 不加DTT，不打开亚基内二硫键，蛋白不去折叠，不利于SDS充分结合到蛋白亚基上，导致带电不均，电泳迁移不完全依赖分子量，可以解释楼主无DTT条带成U型改变（U型改变在不用浓缩胶直接用分离较的连续胶中很多见，如EMSA）。
  2 但二楼所言“不加DTT的时候由于二硫键没有破坏，蛋白折叠的比较紧密”并不等同于迁移速度变快。我倒认为加了DTT去折叠完全SDS结合充分，条棒状更规则，所受阻力更小，迁移速度更快，如此则与楼主条带恰相反了。
  需要做过非还原SDS电泳的战友澄清。
  3 楼主加DTT的似乎是2条带，可界限又不是特别分明。总体感觉浓缩胶的效果不好（抑或没使用浓缩胶？也不像）。楼主能否对电泳和样本的背景内容再详细叙述一下？

• wsll (2014-5-23 17:25:39)

  
  
  我的电泳和普通的SDS-PAGE没什么不同：
  5%-15%，配方是按分子克隆的加的。方便大家研究将全图附上。

  
  18764367.jpg

• yueban-1147 (2014-5-23 17:25:59)

  
  我认为原因是分子内的二硫键可能对于该蛋白的空间构相有着非常重要的作用，加入了还原剂以后，分子内二流见打开，这样会导致分子线形程度更高，在同等电荷的情况下，变性蛋白的在Gel filtration上的迁移速率比折叠蛋白的要慢，因而在电泳上表现为迁移得更慢了。我想也许是这个原因．

• fox_79 (2014-5-23 17:26:22)

  
  楼主是不是先分析下你的目的蛋白结构, 看其中是不是有很多的二硫键参与蛋白构像的形成?如果二硫键很多, 那么楼上所言很有道理的.