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【求助】诚心请教Bradford法测定蛋白浓度？
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我是第一次测定蛋白浓度，在园子里查到了bradford方法。配置了1mg/ml的BSA和考马斯亮蓝G-250溶液（10mg考马斯亮蓝G-250溶解于5ml的95%乙醇中，与10ml85%磷酸混合定容到100ml）。但是马斯亮蓝G-250溶解于5ml的95%乙醇时，仍有一些不溶的小颗粒，加入磷酸后溶液变成棕红色，但用水定容到 100ml后变成深蓝色。将1mg/ml的BSA和待测样品（用于双向电泳）分别加入到1ml考马斯亮蓝G-250溶液测浓度时，出现更多不溶的蓝色颗粒，A595是负值。我测了一下考马斯亮蓝G-250溶液在460nmOD值是0.3左右。现在实验急需蛋白浓度，而我一切都是刚接触，请大家多多帮忙找找原因，非常感谢！
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最新回复
linlinstar (2014-5-23 17:53:05)
你可以看看汪家政编的那本《蛋白质技术手册》，园子里有共享，如果不能看，请给我你的邮箱号，我可以给你发过去，Bradford工作液是需要过滤的，我们做蛋白，一般测浓度用Lowry's法。
veiwu (2014-5-23 17:53:31)
汪家政的那本书我也看了。我用我们实验室的滤纸过滤了，结果考马斯亮蓝溶液几乎无色了，测定的标准蛋白A595都是0.009以下。是不是我的考马斯亮蓝溶液有问题那？颜色是深蓝，我看论坛里说的都是红棕色啊？可是所有药品的用量都和他们一样啊。好犯愁啊。双向电泳用的蛋白也可以用Lowry's吗？谢谢你啊
daod (2014-5-23 17:53:52)
先确定G250和R250没有混淆，这个混淆也可能是蓝色的原因。
其次，粉碎G250后再往乙醇里加，尽量振荡使之完全溶解。
粉碎的方法很简单，用硬纸包上，再用玻璃瓶用力来回滚压几次就搞定，过滤还是有必要的。加入磷酸后溶液变成棕红色，用水定容到 100ml后棕中带蓝或兰中带棕或浅蓝都不为过，深蓝只有加了蛋白后才变。
linlinstar (2014-5-23 17:56:43)
就我所知，Lowry,s法比较耗时，加样得保温30分左右测定，酚试剂可以买到，其他几种世试剂的配置都不复杂，改良后体系以比较稳定，改法测定样品的蛋白浓度不能太高，我们作Native－PAGE和SDS-PAGE的蛋白样品都是用这种方法测定的。Bradford法我们比较省时间。抱歉，我没配过工作液。
veiwu (2014-5-23 17:59:45)
toy (2014-5-23 18:00:09)
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呵呵，两个都是蓝的，我肉眼凡胎，反正区分不了哈，自己加油寻找原因哈
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