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【求助】关于二维电泳的裂解液、水化液的相关问题！
【求助】关于二维电泳的裂解液、水化液的相关问题！
根据GE Helthcare的最新说明，双向电泳中总体来说有两种水化液选择：
1、8M尿素，2%CHAPS，0.5%IPG Buffer，0.002%溴酚蓝，DTT
2、7M尿素，2M硫脲，2%CHAPS，0.5%IPG Buffer，0.002%溴酚蓝，DTT
即第二种水化液比第一种多了硫脲的成分。
由于本人用的裂解液是“ 7M尿素，2M硫脲，4%CHAPS，2%IPG Buffer，65mM DTT”，所以我这次想尝试使用第二种水化液，这样使裂解液与水化液尽量保持一致。
而且也有一些文献说：使用含硫脲的水化液可以使2DE后胶上面碱性端中低分子量区可分辨的蛋白质点明显增多，且蛋白质点更加锐利、清晰；但是又在丁香园上看到有战友说硫脲会干扰阳极的等电聚焦。
本人正犹豫中，因为以往从没用过第二种水化液，不知效果会怎样。请广大战友指教！！！多谢！
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最新回复
xue258 (2014-5-24 09:39:40)
=pkchen= (2014-5-24 09:39:58)
我们很多时候加溴酚蓝时，都是其他成分都加入后，最后加几颗溴酚蓝粉末进去（即自己估算：痕量）。但这样也出现过问题，有时浓度过高，而有时颜色又太浅。
0.002%是指南推荐的浓度。即先将100mg的溴酚蓝以及60mg的Tris-base加双蒸水至10ml，配成1%的溴酚蓝储液。然后，在配制水化液时，每25ml水化液加入50ul的溴酚蓝储液，即达到了0.002%的浓度。
溴酚蓝作为一种指示剂存在，对一向和二向都有作用。特别是二向时，当“溴酚蓝染料前缘距凝胶底部1mm时停止电泳”。所以，最好还是加入溴酚蓝。
ritou1985 (2014-5-24 09:40:16)
我做膜蛋白的2DE,刚做了一次.发现是空胶,蛋白没溶解进去.请问有没有针对膜蛋白的水化液?
=pkchen= (2014-5-24 09:40:36)
关键是看裂解液。因为一般水化液和裂解液的成分是相似的。
如果你跑出来是空胶，很有可能是裂解液的问题，或是其他步骤的问题。
如果实在不行，那就用试剂盒吧，PIERCE和BIO-RAD都由膜蛋白提取的Kit。
yjf1026 (2014-5-24 09:40:59)
2%IPG Buffer的浓度会不会太高了些？
caihong (2014-5-24 09:41:17)
2%IPG buffer没问题,但主要是针对某些组织样品来的,而我培养细胞中加的就只有0.5% IPG buffer了.具体可以去看一下Sample preparation for two-dimensional gel electrophoresis, Proteomics 2003, 3, 1408–1417
ritou1985 (2014-5-24 09:41:41)
谢谢，我在看看其他的资料，对了，如果加如硫脲对样品的溶解性有影响吗 ？
=pkchen= (2014-5-24 09:42:37)
文献指出，在裂解液中加入硫脲，可显著提高蛋白质的溶解度，尤其是膜蛋白！
此外，2%的IPG Buffer没有问题！指南指出，裂解液中的IPG Buffer最高浓度就是2%，作为增溶剂，它可以减少蛋白质的聚集，增加蛋白质溶解性。但是作为一种离子成分，IPG Buffer对一向聚焦是有影响的。故在水化液中，我们通常只加0.5%的IPG Buffer，目的就是降低最后总的上样液中的IPG Buffer浓度，从而减少其对于等电聚焦存在的影响。
=pkchen= (2014-5-24 10:34:24)
QUOTE:
呵呵，看到你在其他贴上的提问。理论上讲，水化液（及裂解液）中的CHAPS是可以用Triton X-100或Triton X-114来代替的，因为他们同为去污剂的作用。
但是，Triton X系列是非离子型去污剂；在这种去污剂中，相比其他的去污剂，蛋白质有时易发生聚集。Triton X系列是我们最初常使用的一类去污剂，但后来的研究证明，两性去污剂CHAPS(2%-4%)的效果更好，且应用范围更广，可用于溶解多种类型的蛋白质。
同时，你应要注意你的样品是否污染较重。特别是脂类的污染，因为膜蛋白能与脂类结合，从而降低可溶性；并且，脂类与去污剂形成复合物，降低了去污剂作为蛋白质溶解剂的作用。这时，你可能需要更强的变性条件及额外量的去污剂。正如《蛋白质技术手册》所言：“对于膜脂蛋白须用10倍或更高浓度的Triton X-100来溶解”。
所以，你可以尝试调节Triton X的量，或是使用丙酮沉淀法，它也可以去除一些脂质。如果溶解效果还不好，甚至可以使用离子型去污剂SDS（当然，后续处理太烦，因为它影响聚焦）。实在没办法了，那就只能多申请点经费，买试剂盒吧。：）
ritou1985 (2014-5-24 10:34:46)
对了，请问在水化液里加入Tris base.应该有利于溶解膜蛋白吧，不知道对聚焦的影响大不大？浓度应该在什么范围？
=pkchen= (2014-5-24 10:55:43)
根据GE Healthcare的说明，水化液推荐的常用配方液也就只有“8M尿素，2%CHAPS，0.5%IPG Buffer，0.002%溴酚蓝，DTT”和“7M尿素，2M硫脲，2%CHAPS，0.5%IPG Buffer，0.002%溴酚蓝，DTT”而已。且Tris-base是个缓冲碱，必然会提高溶液中的离子水平，这对等电聚焦的影响是巨大的。在等电聚焦过程中，遇到“电压上不去”等情况就经常是导电性和离子强度过高造成的。因此，要求将最终的样本液（加完水化液后的）中的盐浓度小于10mM。
由此看来，在水化液中加入Tris-base是不合适的（我也没见其他人这样做过）。当然，裂解液是可以有Tris-base的存在的，如“7M Urea，2M Thiourea，4％（w/v）CHAPS，40mM Tris-Base，40mM DTT，2％ IPG Buffer”。只要最后与水化液混合后被稀释就没有关系了。在这种情况下，就要保证上样的水化液的体积要达到一定的比例，否则其不到稀释平衡的效果（水化液的成分是最适合等电聚焦的）。
avi317 (2014-5-24 10:55:59)
Tris-base的作用是单单提高pH值.估计提取过程在高pH值提取效果更好吧
ritou1985 (2014-5-24 10:58:14)
看看这次出来的结果 怎么样？
fei1226com (2014-5-24 10:58:35)
我们使用了第二种水化液,但是电压根本就没有升上去...
=pkchen= (2014-5-24 10:58:55)
Tris-base本身并没有多强的溶解蛋白的作用。但是，裂解液中当尿素、硫脲及Tris一齐存在时，据说溶解蛋白的能力会有显著提高。
=pkchen= (2014-5-24 10:59:17)
QUOTE:
呵呵，电压上不去有很多原因啊。不一定就是水化液的原因啊。有可能你的样品处理有问题，盐份太多等等其他问题。
我们以前一段时间全用的是第二种水化液，效果还是很不错的。之后一段时间因为进口硫脲用光了，一时没有了，所以换了第一种配方。两者聚焦时的明显区别就是：第一种水化液在往8000V爬的时候，稳而缓慢；第二种则爬得很快，陡然上升。并没有出现什么问题啊。
再说，电压升不到最高不一定就有问题，只要伏特小时数达到要求，一样可以跑出很漂亮的胶（当然，电压也不能太低！）。
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