【求助】原核表达如何知道蛋白是可溶性表达

最新回复

• caihong (2014-5-24 15:09:44)

  
  可以用溶菌酶破壁后离心,分别跑上清和沉淀.

• hustwb (2014-5-24 15:10:07)

  
  做这个蛋白的目的是什么呢，是做包含体还是做可溶蛋白呢？有没有其他的破菌方法或器材。一般不建议用溶菌酶，效果并不好，而且还会引起很多误导的结果。
  如果没有超声仪和高速离心机的话，没有太好的方法。

• ukonptp (2014-5-24 15:10:33)

  
  其实有两种比较简单的方法，一种是反复冻融，另外一种是更加有效的，现在市场上有卖的玻璃珠，可以在震荡器上破碎蛋白，然后离心，取上清和全蛋白比较。
  后一种方法现在是很多实验室很流行，因为无需培养大量蛋白，有5毫升就够了。

• ukonptp (2014-5-24 15:10:50)

  
  不知道我说的是不是清楚。
  
  1，取一毫升诱导后菌液离心加入100ul悬浮，做全蛋白。
  2，取5毫升全菌（每次一毫升加入EP管离心，5次），加入100ul水（最好是50mMpbs，1mMEDTA，1mMDTT，1mMPMSF，如果你想精确的话），然后悬起来，加入约50－100ul的小玻璃珠，然后在震荡器上震荡5分钟（每次一分钟，然后放在冰上），最后离心10分钟，取上清100ul左右。
  3，分别加入sds loading buffer，跑胶。
  效果和超声几乎一样

• glass (2014-5-24 15:11:18)

  
  “小玻璃珠”哪有的卖啊？
  没见过哦！

• jrwyyplt (2014-5-24 15:11:43)

  请问是什么样的小玻璃珠阿？贵不贵啊？还有反复冻溶是怎么做的阿？谢谢！！
  因为我是想看看我的蛋白是否是可溶性表达，因为后面想看看这个蛋白是否可以增强菌的生存率，所以希望可增强他的可溶性。谢谢！

• 紫烟 (2014-5-24 15:12:01)

  小玻璃珠还蛮贵的,拜尔迪有卖

• kewanqi2011 (2014-5-24 15:12:21)

  反复冻溶就是放到-20或-70，冻上以后，再拿出来融化，如此重复，一般3次即可。

• owanaka (2014-5-24 15:12:40)

  
  呃，非常感谢！！
  我这两天跑胶，我的浓缩胶（5%）和分离胶（12%）在拨胶下来时不用切就分开了。而且分离胶是发白的不透明，不知道为什么？

• ukonptp (2014-5-24 15:13:00)

  玻璃珠是
  Glass Breds
  sigma的
  不贵^_^。
  我说的protocal中的数字都是我们实验室n次试验得到的经验值，和超声比较过很多次的。效果几乎一致。

• owanaka (2014-5-24 15:13:26)

  呃，非常感谢！但是我只是想确认一下它是否是可溶性表达就好，所以想不花钱，（能省则省了）不知反复冻溶效果还好吗？
  还有想请教反复冻溶的具体步骤。是菌液离心后，加上样缓冲液反复冻融吗？然后再离心用上清点样跑电泳就可以吗？
  谢谢赐教阿！！