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【求助】WESTERN 中的转膜、发光等几个问题
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在实验过程中出现一下几个问题，需要寻求各位战友的建议：
1. 转膜时多次出现预染MARKER的14KD亮黄色的没转过去，并且转膜后的胶染色后，证实转膜效果欠佳。（整张或分别转膜均出现过）
2.ECL出不来结果，可DAB能够出来？
3.暗室里能够看到发光的条带，可是胶片上什么都没有？如果是胶片曝光，但是有时却又可以。
4.手工洗片时，显影时间与温度的关系大吗？胶片在显影液中什么程度认为比较合适？
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最新回复
ladyhuahua (2014-5-24 15:21:43)
能看到光。可胶片上没有条带。明显是你显影液定影液的问题。这可能也是dab能出结果，ecl出不来的原因。
温度关系不大。
显影定影一般2分钟足够
cj_mondy (2014-5-24 15:22:02)
显影定影一般2分钟足够 ?
这样的时间是不是太长了点，我一般都在20秒内，能出条带就可以了。时间长了，片子都发白，不透明了。
zsxan1990 (2014-5-24 15:22:24)
1转膜:我一般30V过夜转,效果很好,我用的是普利莱的4条带的预染marker,很 清楚,
2 ECL比DAB敏感的多,ECL的抗体稀释度很高的.我一般一抗是1:2000.二抗1:4000,室温孵育1小时,37孵育我试过,会有很多非特意结合,室温孵育很好,没有背景.DAB的抗体稀释度没有这么高,一般都是1:200起,这么高的抗体浓度,ECL反而检测不出来
3 感觉是显影的问题,我一般都用一个放射自显影的标签来检测显影和标记胶片的正反面,一般显影就是20-30秒钟,可以在显影过程中,提取胶片在红灯前观察,看到有黑色的带出现,立刻用清水漂洗,然后定影,洗出来的片子都是很好的
gemei0115 (2014-5-24 15:23:29)
楼上的想请问，一抗的浓度不是越大越能够出结果吗？
另外，我的胶片在显影液中大约过10分钟左右，胶片变得黑黑的。
DONT (2014-5-24 15:23:50)
QUOTE:
如果暗室里能够看到发光的条带，可是胶片上什么都没有可能也是这样的原因造成:即你的目的蛋白量比较多 所以它结合的一抗 二抗也相应比较多 然后加上底物暗室反应时 由于反应过快 底物短时间内消耗掉
(及有可能在你看到有发光条带的几秒)然后你压片时 便出不来条带
而你有时又可以 则即有可能在你之前洗膜程度 时间不同 导致某些抗体被洗掉 相当于减低蛋白浓度 偶尔出现了条带
以上纯属参考意见
DONT (2014-5-24 15:26:47)
QUOTE:
不是一抗浓度越大越好的太大的话 非特异性结合出现的可能性也越大的
gemei0115 (2014-5-24 15:27:27)
QUOTE:
在实验过程中，出现过发光条带很快消失的情况。DONT (2014-5-24 15:28:16)
QUOTE:
那就有可能是我上边说的情况你可以适当减少蛋白的上样量试试
或者你也可以先用不同的上样量跑一板胶
考染看看蛋白量
视情况定应该加的蛋白上样量
one (2014-5-24 15:28:39)
大家好！
我做了5次western都没出结果，胶片上连背景都没有，曾想是转膜不好，但 用丽春红能染出条带来，可为啥就是不出结果？甚至连背景也没有！定影显影液一般配了可用多久？有沉淀吗？
抗体应该没问题，我师兄师姐都做出来了.
脑组织在－８０度能保存多久？１０个月的还能做吗？
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