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【求助】蛋白为什么不表达
【求助】蛋白为什么不表达
我过去诱导的样品，pet30a（＋）作为载体，在DE3（BL21）作为表达菌株，过去曾经诱导出过带，但现在却不表达了，温度没变，还是32度，其他条件基本都没变，挑单菌落过夜摇菌，然后活化3小时后进行表达。
请问各位高手常见的原因是什么？谢谢了
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字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2014-5-24 17:32 作者: zhihui小新 来源: 分析测试百科网
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最新回复
orangecake (2014-5-24 17:32:26)
质粒是不是丢失了，是甘油菌保存后活化的吗？重新转一次质粒看看
DONT (2014-5-24 17:36:08)
最好以OD值为准，菌体尽量不要长过OD0.6
生长期37度，诱导控制在30度一下
pengke1983 (2014-5-24 17:36:24)
平板上的菌是保种的阳性菌吗？我的建议：(1) 是不是在阳性菌液保种时出现问题，可换另一株阳性菌再做一下；（2）先把你保种的阳性菌抽质粒做个酶切再次鉴定一下，表达体系应该不会有问题，因为你先前已经做出来了。
66+77 (2014-5-24 17:36:40)
拿你的阳性克隆再重新快转一次吧
bl21菌株好象不是很稳定
JK.jon (2014-5-24 17:36:55)
将你的保存菌株划平板，挑出几个单克隆，通过pcr鉴定质粒（表达基因）的存在；然后把几个阳性克隆分别摇菌诱导表达，PAGE电泳检测，看哪几株表达，哪一株表达的好。
我以前做过，即使全都是阳性菌株，表达量相差很大，有的表达很多，有的几乎看不见；这可能与菌株，诱导时的OD值等有关。
若甘油保存菌株，浓度要在8-10%（pET表达宝典建议），过高容易脱质粒。
zwsyrt (2014-5-24 17:37:12)
实在还是表达不出来，就换一下菌株，用BL21（DE3）plys菌株，这是一种严紧型的菌株，可以抑制诱导前目的蛋白的微量表达，因为有时目的蛋白的这种微量表达可能会使菌株的生长受到影响而以制止了诱导后的蛋白表达。
还有关于OD值的问题，不一定就要一定小于0.6，这要看蛋白的性质，我就做过一个蛋白的表达，我一般使用的OD值在1.5以上，因为我的目的蛋白对菌体的生长有抑制，所以要让菌充分生长后才可对其进行诱导表达，这还要你在摸索一下，诱导后温度的控制主要和蛋白是否可溶比较有关系，至于和能否表达的关系就不大了，还是要从诱导前宅原因。
mysmdbl (2014-5-24 17:37:58)
不知道楼主现在的试验怎么样了？
lixi559 (2014-5-24 17:39:39)
我也碰到类似的情况,和LB培养基也有关系,特别是在南方很容易潮湿,可以换一下新的LB
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