【求助】包涵体复性--希望大家给点建议

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• 00无名指00 (2014-5-24 18:06:24)

  
  我个人倾向于采用稀释复性的方法，那种装在透析袋中采用透析的方法逐渐降低溶液中变形剂的方法不是很好。最好是通过稀释的方案，将变性蛋白的溶液逐滴滴入复性液中，至于复性液，最好作一下筛选。详细的方案冷泉港实验室编写《蛋白质纯化与鉴定实验指南》中有详细地描述。

• 04906 (2014-5-24 18:06:49)

  如果用稀释的方案,请问试过用复性液逐滴滴入变性蛋白的溶液中的办法?如果试过,跟你说方法会有什么差异.我感觉将变性蛋白的溶液逐滴滴入复性液中是不是变化太过剧烈.

• 00无名指00 (2014-5-24 18:07:19)

  
  我是把变性的蛋白逐滴滴入一大杯复性液中间，同时用磁力搅拌子搅拌，当然如果变性的蛋白量有限，也可以加入到50ml的离心管中的复性液中，每加若干滴摇匀，计算好时间，不要过急的把所有变性的蛋白质一下子都加进去。这样的好处是蛋白质和的浓度突然变得非常低，分子间的作用变少，主要是分子内部的作用。还有你说的将复性液逐滴滴入变形蛋白中的方法，虽然条件变化比较缓慢，想象中似乎这样有利于蛋白的折叠，但是蛋白浓度非常高的情况下，实际上是有利于分子间的aggregates的形成，你可以做一个试验对比一下同样的复性液，这两种方案哪一种复性效率更高。另外，复性液的配方很灵活，需要筛选，并没有哪一种配方是万能的。祝你好运啊！

• 966735obeng (2014-5-24 18:07:46)

  
  如果已经表达出包涵体，可以先裂解，然后用稀释活透析方法复性，活性达到满意后再进行纯化。
  一般1g包涵体在20ml裂解液中溶解，根据复性实验的因素确定需要多少克包涵体，适当的时候，可以一次摇2L培养基。
  复性主要考查的因素包括：起始蛋白浓度、pH、温度、复性时间、变性剂Urea浓度、盐浓度、氧化还原剂GSH/GSSG浓度与比例、稳定剂Gly、L-Arg、某些折叠促进剂如蔗糖、多元醇等。因素比较多，可以做一个多因素两水平的正交实验，然后跳出4个影响最大的因素，做4因素3水平正交或单因素实验。从经验上说，影响因素中最不易确定的是：温度、盐浓度、氧化还原剂的浓度与比例。起始蛋白浓度一般0.05－0.1mg/ml，pH7.4－8.5，Urea 1－3M，Gly 10%，L－Arg 0.4M。不过蛋白性质差别很大，我说的也不一定适用，只能用实验来验证。
  我觉得可以先做稀释复性，摸索一下关键因素的影响，然后再考虑做透析复性。透析时，一般将包含体裂解液直接装入透析袋（50ml一下装液量），一定温度下，置于大体积（10 L）缓冲液中进行复性。

• pengke1983 (2014-5-24 18:08:22)

  太感谢大家的帮忙了，我目前已经复性出部分蛋白，但复性率还是很低，我争取再改进。但又出了新问题，我3天前用SP柱纯化复性后的蛋白（约有80%纯），当时跑SDS-PAGE目的带还看得清楚的。当时没做进一步处理，直接放在4度。但现在再跑，目的带却看不见了，杂带（还原电泳在40KD以上）却能看见。请问大家这是我的蛋白本身容易降解吗？还是其他原因？
  谢谢！