【求助】请问我的转膜算是充分了吗？应该怎样的转膜...

最新回复

• greenbee (2014-5-28 16:12:16)

  
  感觉时间短一些，可以延长到１ｈ；另外你看到滤纸上的颜色可能是预染ｍａｒｋｅｒ脱落的颜色（有些预染蛋白和染料共价交联的不充分），未必是蛋白。

• yjf1026 (2014-5-28 16:12:39)

  
  胶在转膜前要平衡好（在转移缓冲液中平衡15－30min），去处SDS，不然蛋白会很快被SDS带出膜的空隙到达滤纸上

• 101010 (2014-5-28 16:12:55)

  我的蛋白分子量较大，有２００ＫＤ，请问转膜条件应该怎样为宜？谢谢高手啊！

• ukonptp (2014-5-28 16:13:23)

  QUOTE:

  原帖由 101010 于 2014-5-28 16:12 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  我的蛋白分子量较大，有２００ＫＤ，请问转膜条件应该怎样为宜？谢谢高手啊！

  楼主，要加油拼命转啊，5％胶湿转几个小时乃至过夜都没关系，永远不要担心过转。关于你上面的疑问，我给你打个比方，看你能否理解：
  转膜也是一种跑胶。跑胶是蛋白进入分离胶，转膜是蛋白迁移出分离胶。跑胶时蛋白在胶内迁移有快慢之分，蛋白迁移出凝胶到膜上也是这样的，小分子快，大分子慢，20kd在胶上跑6cm的时候200kd可能只跑了0.3cm。
  所以，大分子留在胶上，小分子可能穿膜而过，中分子在膜上就是你的疑问的原因。当然胶有一定厚度的，同一蛋白也是要跑完胶的厚度才能完全到达膜上，靠近膜的地方先转上去，离膜远的地方后到膜上。所以即使对于某一具体小分子而言也可能同时存在过转、膜上、胶上3种状态。
  蒋兄200kd，要加油努力拼命转啊！
  

• 101010 (2014-5-28 16:13:51)

  QUOTE:

  原帖由 ukonptp 于 2014-5-28 16:13 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  
  楼主，要加油拼命转啊，5％胶湿转几个小时乃至过夜都没关系，永远不要担心过转。关于你上面的疑问，我给你打个比方，看你能否理解：
  转膜也是一种跑胶。跑胶是蛋白进入分离胶，转膜是蛋白迁移出分离胶。跑胶时蛋白在胶内迁移有快慢 ...

  群主，，我现在用的半干转，大概要用什么条件啊？
  刚刚看到这个，呵呵，还在另一个帖子上问你呢．好象是不好掌握条件，怕小分子过了大分子还没有上去，摸了几次都不好，要靠你的经验了．谢谢拉！

• 101010 (2014-5-28 16:14:42)

  胶在转膜前要平衡好（在转移缓冲液中平衡15－30min），去处SDS，不然蛋白会很快被SDS带出膜的空隙到达滤纸上
  
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  转膜缓冲液中不也有ＳＤＳ吗？请教，谢谢！

• INK (2014-5-28 16:14:59)

  
  我看的BIO-RAD的半干转印仪说明书，上写的0.75的胶15分钟，根据蛋白分子量的大小调节电压或电流，不知道行不行

• vvmmoy (2014-5-28 16:15:18)

  滤纸上的颜色不是蛋白的而是用的蛋白Marker颜料的颜色。考染凝胶，发现蛋白条带尚存，最有可能是转瞙的时间太短，可以增加到45min，没必要一个小时。另外，就是你是恒压转的话，电流要根据胶的大小来计算
  蛋白分子量较大，有２００ＫＤ，最好用湿转，转2－3个小时比较好。

• vvmmoy (2014-5-28 16:17:42)

  我用BIO-rad的半干转，15分钟0.05a，最后可以用抗体标记出55KDa的条带

• 101010 (2014-5-28 16:18:06)

  
  谢谢各位，我转５０ＫＤ左右的也非常好，但是２００ＫＤ的就不知道到底啥条件．
  可能如如 战友所说，用湿转比较好，再次感谢！