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【求助】这样能表达吗？
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我采用PET30a上的Nde I和Bam HI两个酶切位点，将上面的融合标签切去了，再连上含相同酶切位点的目的基因，这样能表达出我的目的蛋白吗？我在BL21（DE3）和BL21（DE3）pLysS两种菌中都诱导表达过，就是表达不出来，请问是怎么回事呢？
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字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2014-5-28 16:45 作者: kewanqi2011 来源: 分析测试百科网
最新回复
hot_hot_hot (2014-5-28 16:46:09)
你首先要考虑稀有密码子的问题，其次你要考虑RNA结构的问题
再次你要考虑N端的氨基酸的稳定性问题,
还有你分子量的大小问题(>70KD的表达量可能有问题),GC含量>70%的表达很困难
由此:我觉得你应该先做WESTERN BLOTTING 检测一下是表达量低还是完全没有表达
lxh031 (2014-5-28 16:46:33)
kewanqi2011 (2014-5-28 16:46:56)
请问楼上的，换什么样的载体好呢？在选载体时需要考虑哪些因素？
fei1226com (2014-5-28 16:47:20)
pET32, pQE30
促进蛋白质的表达方面
小糖块 (2014-5-28 16:47:42)
QUOTE:
pET32含Trx标签，促进二硫键形成，可以改善目的蛋白的溶解性或正确折叠。
好象对于提高表达量作用不大吧
小糖块 (2014-5-28 16:48:09)
你首先要考虑稀有密码子的问题，其次你要考虑RNA结构的问题
再次你要考虑N端的氨基酸的稳定性问题,
还有你分子量的大小问题(>70KD的表达量可能有问题),GC含量>70%的表达很困难
由此:我觉得你应该先做WESTERN BLOTTING 检测一下是表达量低还是完全没有表达
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为何>70KD的表达量可能有问题呢？有人表达过更大的蛋白耶
小糖块 (2014-5-28 16:48:30)
表达不出来原因很多，对于稀有密码子的问题，可以试试宿主菌Rosetta
或者早点换载体吧。
kewanqi2011 (2014-5-28 16:49:31)
我们实验室资源有限，只有PET30a和PET28a,不知道换用PET28a行不行呀？
plaa (2014-5-28 16:49:53)
可以试试pET28a，但给下游蛋白的纯化带来困难，杂带多。
kewanqi2011 (2014-5-28 16:50:18)
QUOTE:
我只需在sds-page中能明显地看出表达条带，然后再用发酵液饲喂一下虫，看是否有杀虫效果就可以了，不用纯化蛋白。xiaoxiaoniao (2014-5-28 16:50:38)
PET30a和PET28a基本差不多，都含有两种标签，30的酶切位点多一些
别去做无用功了，换其它的
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