【求助】western时可以看到荧光条带，很快消失？

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• qqq111 (2014-5-29 10:21:28)

  
  我觉得是你的抗体浓度高.建议你把两种抗体都重新做下点杂交,一抗可以1:1000 1:1500,1:2000,1:2500,1:3000......二抗1:10000,1:15000,1:20000......选择刚出现信号的前一个浓度或者就是这个浓度.还有可以延长洗涤时间,15MIN一次.其实洗涤很有学问,时间,盐离子强度,还有洗的摇晃的强度.

• bongte (2014-5-29 10:21:48)

  谢谢哈！！我前一段时间也用同样的稀释倍数，做同样的抗体，步骤都一样，但是持续的时间还是比较长的，只是最近出现持续时间短，我就不知道哪儿出问题了！！

• tangxin_80 (2014-5-29 10:22:19)

  是不是浓度太高，发光底物很快消耗掉有关。但是以前同样也可作出来，就不太明白了。

• ukonptp (2014-5-29 10:22:43)

  信号强是可以肯定的了，虽然步骤都一样，可能的原因有1个：
  就是抗体可能有点凝集沉淀到管子底部，所以一开始吸的时候上面的浓度低于初始的平均浓度，往后吸下面的浓度高于开始的平均浓度，所以信号就明显提高了。这种情况常发生于50％甘油保存的二抗（一抗比较少用这种方法保存）。今后用前旋振混匀就可以了。现在当然要大胆稀释抗体了。
  我待的实验室曾遇到过换了二抗一开始怎么做都作不出来的情况，而后来突然就好了，当时推测也是以上原因。至于实验水平提高操作更加规范引起的信号增高也是可能的，但不会如此明显。

• ukonptp (2014-5-29 10:23:05)

  
  补充一句，中杉分装santa的一抗倒是极有可能使用50％甘油保存的，你仔细看看说明书。
  另有一个提示：如果推荐－20度保存并且抗体吸起来很粘稠，那么一般是使用50％甘油保存。