【求助】关于western blot,达人指点

字体: 小中大 | 打印发表于: 2014-5-29 15:13 作者: 911 来源: 分析测试百科网

心情太差了！这几周一点结果都没出来。连actin都没跑出来。
之前在一个实验室做的都挺好，条件也都摸索好了，也做出结果。
后来由于校区搬迁，换到另外一个实验室，所有western的bio-rad仪器是全新的，我第一个用。以前也是用的bio-rad的一套一摸一样的。
然后用以前摸索好的条件跑一样的样本，做以前作出来过的蛋白。现在是什么也跑不出来。一直重复作，还是无果。
就是用100V 转90分钟（这是以前做出的条件），后用立春红染色，蛋白条带非常非常浅。之后曝光什么也没有，胶染色没有蛋白残留，今天调整100V，1h.还是actin都没有
终于有个朋友发现问题：以前用的是1.5mm的玻璃板，现在用的0.75的玻璃板，厚度差了一半！！转膜肯定是全转走了。
大家觉得什么问题，准备明天转膜条件再减点下来试试。有人做0.75mm的玻璃板，一般转膜条件是多少？能不能给个大致的提示，我好再摸索一下。
心情有点不好，所以有点罗嗦，大侠们不要笑我，哎，可能也是自己不够细心吧。

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最新回复

summerxx (2014-5-29 15:14:29)

有人做0.75mm的玻璃板，一般转膜条件是多少？
我今天也在做western,0.75mm的玻璃板，一般转膜条件（湿法：200v,1h).
今天转膜的时候居然转出两个大气泡来，真是郁闷啊。
911 (2014-5-29 15:14:53)

不是吧，你这个条件太高了吧？薄的胶应该转的更快才对
8princess8 (2014-5-29 15:15:11)

我也在用bio－rad 0.75mm的板，湿转34伏过夜，大概800分钟，效果很好。也有试过100伏1小时的，都转的过去。
有气泡是因为没有赶干净气泡，最好把三明治淹没在transfer buffer中赶。
911 (2014-5-29 15:15:32)

楼上战友：我的意思是不是100V,1h太久了，会不会转过头？？转过头的话不是什么蛋白都没了？
newway (2014-5-29 15:16:36)

试试过夜吧，转膜效率会更高，我一般很急着用才用100伏
911 (2014-5-29 15:17:00)

过夜的话那一个western不是要做三天了？
yonger (2014-5-29 15:17:22)

无需过夜，
应该说0.75 厚度胶，100V 90min 转膜条件是用于大多数蛋白的湿转，应该不会过，不知你的蛋白分子量如何，一般120KD 以下的蛋白，用此条件问题不大，如更大。则可适当延长时间，你的条带淡，首先确定你的转移缓冲液及膜三明治的配件及组装有否问题，甲醇有无问题，如排除很可能是蛋白降解
911 (2014-5-29 15:18:12)

别人的实验室做我的蛋白没问题，应该排除蛋白降解的问题，难道0.75mm的胶和1.5mm的胶转膜条件是相同的么？甲醇是新买的。电转液也是新配的。左右的配件是新的。组装就是从黑色那边开始，是海绵、滤纸、胶、膜、滤纸、海绵。应该没问题。实在找不到原因了。急昏了。之前同学说很可能是转膜条件的问题，我还庆幸好歹找到原因了，现在听各位一说，我又糊涂了。这个可能的因素大家都觉得是可行的说。
idoww (2014-5-29 15:18:33)

据说在三文治里垫两张膜，可以看出有没有over-transfer
有人试过么？