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【求助】极郁闷的WESTERN
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做了快三个月了,还是没有结果.
我做的是肺组织中肺血管平滑肌膜蛋白.组织块大约有0.1-0.2ML大(在EP管中看的).
裂解液:
1、取组织，加入 10ml Buffer A 于冰上充分匀浆。
2 离心 800rpm，4℃ 离心 10min 后，所得上清液转入超速离心管。
3、100000g，4℃ 离心 1hr。弃去上清，沉淀用适量的 Buffer B重悬，4度过夜 后分装至 EP 管，Eppendorf 台式离心机 10000rpm，4℃ 离心 30min。
4、收集所得上清液即为膜组份。
Buffer A：0.32M 蔗糖，5mM Tris-HCl（PH 7.5），120mM KCl，1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Aprotinin。冰上预冷。
Buffer B：20mM HEPES（PH 7.5），10% 甘油，2% Triton X-100, 1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Aprotinin。冰上预冷。
制胶:分离胶为7%,浓缩胶为5%.
每孔25UL,蛋白量试过50,100,150,200ug／孔．
电泳：浓缩胶６０Ｖ，分离胶１１０Ｖ．
转膜：ＢＩＯ－ＲＡＤ半干转，１５Ｖ，３５分钟（我的目的蛋白是６９Ｋ Ｄ，转膜仪要求电压不过２５Ｖ，我有同学做６５ＫＤ，转３０分 钟，挺好的）用预染ＭＡＲＫＥＲ时，发现最后一层滤纸上也有蓝节 带，而且特别清楚，其它层滤纸（我一共用三层）以及膜上＼胶上也 都有，但都没有最后一张滤纸清楚
丽春红染色：每次染都不是很清楚，有一次做了个膜的考染，有条带，所以 以后就不做这步了．
封闭：伊利高钙脱脂奶粉，室温一小时或过夜色．
一抗：ＳＡＮＴＣＲＵＺＥ，说明书推荐１：１００－１：０００，
试过１：１００，１：６００，１：１２００．
时间上试过４度过夜，３７度二小时，室温二个时．
二抗：中山的，１：５００，１：１０００．１：１５００．１：３０００ 时间：试过室温一小时，３７度一小时
ＥＣＬ显色．
无论什么浓度，ＡＣＴＩＮ都能出的很好，而目的带开始一直没出现过，
最近二次：
１：２００ＵＧ上样量，封闭４度过夜色，一抗１：６００，３７度二 小时，二抗１：１０００，３７度一小时．显色时整个膜全是亮 的，看不出哪里有亮度的区别，底片全曝光．
因为在跑电泳时，预染ＭＡＲＫＥＲ没跑出条带，只是一片拖尾的蓝色，但考染能看到蛋白条带．不知道是不是这个有影响．另外考虑抗体浓度过高．
２：２００ＵＧ上样量，封闭室温１小时，一抗１：１２００，４度过 夜，二抗１：３０００，３７度一小时．
显色后，肉眼可见膜顶端发亮（不是我的目的带位置），曝光１分 钟，模模糊糊的一片黑，顶端最黑，看不出特意性条带．但另一张 膜的ＡＣＴＩＮ，肉眼就可见非常清楚的条带（一抗1:1500, 二抗 １：３０００，其它一样）．
此次电泳ＭＡＲＫＥＲ仍没有出来（不知什么原因，以前从没有过），怀疑电泳有问题，蛋白没跑开，但ＡＣＴＩＮ 又做的那么清楚，有点晕！
打算下次做时减小上样浓度到１００ＵＧ试试，再降低一，二抗浓度，但也有些疑惑，如果上浓度过高引起的，怎么也应当有一点特意条带吧，最多背景深些，现在跟本看不出来．
怎么办呢？请高手指点！
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最新回复
utt0989 (2014-5-29 16:00:27)
个人觉得楼主试验可能存在以下可能：
1、WB 前，首先应确定你的一抗、二抗可以用，没有问题，因此建议不要一开始就跑WB，可以先作点杂交，可以取剪下膜的边角料，一点大即可，然后取你的蛋白可适当稀释，用枪点在膜上，烘干，反复加，一般加5-10ul即可，然后加一抗及二抗 孵育，可将抗体作个稀释梯度，DAB显色，如抗体没问题，会有目的蛋白的印迹，而且可以摸索出最佳抗体的浓度
2、你的蛋白上样量过高，WB 是一种非常敏感的检测方法，一般最低美孔上样0.1ug 即可，如0.75mm 的胶，每孔上样20-40ug 足以，蛋白多当然好，但过分追求浓度高，反而会影响电泳，会导致蛋白条带不易跑开，有的目的蛋白根本没有完全跑开或进入分离胶
3、你的目的蛋白较小一般10%的分离胶足以，不需7%的胶
百分比 (2014-5-29 16:00:45)
我以前按书上给的参考值，好像应当是７．５％，具体的不记得了，选了８％，但跑ＭＡＲＫＥＲ的时候，发现１２０ＫＤ的那条带刚好在浓缩胶的连缘，而目的带也在分离胶的上三分之一处，所以就改了７％的．
谢谢楼上，点蛋白步骤可不可以说的再清楚些．
lixi559 (2014-5-29 16:07:37)
utt0989 (2014-5-29 16:08:02)
首先将处理好的膜平铺在保鲜膜上，不要太湿，但膜也不要干掉点，将待检蛋白适当稀释，用枪点10ul 左右蛋白即可，可反复加，每次5ul慢慢点到膜上，37度烘干后反复点，然后烘干后封闭，相当于转膜，封闭，室温摇荡1小时，洗涤3次，加抗体，37°1h后洗涤3次，加二抗，1小时后，洗涤3次后，加DAB 显色即可，相当于转膜，注意点样的区域尽量小，要设立阴性对照组，抗体可以设个稀释梯度。其实点样完的步骤和WB一样。
mimili_901 (2014-5-29 16:08:24)
SANTA的不好吗?挺贵的了,1ML,2000多.
我周一试试点蛋白.
我的是PVDF膜,是不是用甲醇浸泡,然后用洗吗?洗完烘干?没有DAB了,用ECL也行吧. 一般你们做几个浓度梯度?
有个老师建议我做免疫沉淀,再做WB.目前对这个还不太了解,有谁有具体过程?需要准备什么?
先到园子里搜一遍再回来,希望有人回贴哦
utt0989 (2014-5-29 16:08:51)
PVDF 膜和你做WB 一样处理，浓度梯度，SANTA 的抗体1：50 都作过，一般三个左右即可，显色用DAB 快啊，根其他人借点，那种免疫组化的就行啊
dongdongqiang (2014-5-29 16:09:19)
做了点蛋白，三个蛋白浓度，三个一抗，三个二抗，全出结果了．从中挑了一个．做ＷＥＳＴＥＲＮ，没有结果，好郁闷
dongdongqiang (2014-5-29 16:09:38)
有谁知道如何做免疫沉淀吗?只是因为蛋白含量太低,想提高以后做WESTERN
avi317 (2014-5-29 16:09:54)
我觉得你的问题可能是在蛋白提取上，建议不要提膜蛋白，用RIPA液提细胞总蛋白试一下。
另外膜烤干并不是所有Western都适用的，该方法有可能破坏抗原，所以分子克隆也只是说这一步可作可不做。
dongdongqiang (2014-5-29 16:10:11)
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