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【求助】western实验求助

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2014-5-29 16:43    作者: yysr238    来源: 分析测试百科网

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【求助】western实验求助

之前的实验都挺好，但现在不论如何改条件都不能转上！我用的ＢＩＯＲＡＤ的电泳及转膜系统，使用的电泳液及转膜液的配方都是＜蛋白质纯化与鉴定实验指南＞书上，条件是４００ＭＡ，恒流两个小时．都已经耽误２个多月了，请高手帮忙分析原因，万分感谢！
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  • NBA (2014-5-29 16:43:42)

    你用的是湿转还是半干转。如果是半干转，恒流的大小要看膜的大小，一般转45分钟就行了。另外你用的是什么膜，要不换一种膜试一下

  • redbutterfly (2014-5-29 16:43:59)


    如果是半干转，我们用20V，20分钟，ＢＩＯＲＡＤ转膜系统提示不超过25V，时间不能太长，另外，ＢＩＯＲＡＤ转膜时里面要擦干净，不能都是水，否则短路。转膜滤纸和膜的顺序要正确，滤纸不能太大，否则互相接触也转不上。还有电极安装是否正确，呵呵

  • yysr238 (2014-5-29 16:44:20)


    谢谢上面两位的帮助!我用的是湿转的系统,使用的是millipore的PVDF膜.基本上能对比进行的条件都改过了,现在是觉的是膜的问题.

  • 30moonriver (2014-5-29 16:44:36)


    是否确定是转膜失败呢，有没有考虑到其他问题，
    做个简单实验证明一下
    跑page后马考染色，看看是否有条带，检查是否电泳出问题
    转膜后用立春红染色，看看是否出条带，检查转膜问题
    换抗体。。。。。。。。。。。。

  • yysr238 (2014-5-29 16:47:00)

    非常感谢!胶染过有条带,电泳应该没问题.抗体也没问题,因为还用过GAPDH

  • zwsyrt (2014-5-29 16:49:20)

    转膜时间220mA 2h 4度环境

  • tie8 (2014-5-29 16:49:39)


    转好膜以后染过胶和膜吗？
    都没有条带的话考虑是否转过头了？
    膜用前都处理了吧？
    不知道你蛋白多大？
    我是觉得400MA，2小时这个条件里面电流有点大，时间也有点长

  • DDD (2014-5-29 16:50:06)


    建议将湿转的transfer buffer贴出来看看，我湿转都是300mA 90min（1.5mm gel, protein mw=44-58kd）,pvdf膜用前无水甲醇泡10-30min，Transfer buffer >5min,good luck!
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