【求助】有防止蛋白吸附到EP管壁上的试剂么？

最新回复

• zsxan1990 (2014-5-31 09:06:30)

  一般用硅化的进口ep管，稍微好点

• xyw5 (2014-5-31 09:10:54)

  
  买进口的低吸附的管子吧

• 水母 (2014-5-31 09:11:19)

  
  我本来就不在国内做啊，在香港，管子是进口的，就是不知道是不是硅化低吸附的！谢谢各位，又什么意见再提醒提醒小弟！

• mimili_901 (2014-5-31 09:14:29)

  
  香港。。。如果你们是专门做蛋白质组的应该用的就是低吸附的了

• kuaizige (2014-5-31 09:14:53)

  可以在保存剂中加入适量的BSA

• 水母 (2014-5-31 09:15:16)

  我做的是Kinase assay，substrate是用beads连着的，是研究细胞lysate里面的kinase活性，反应完后wash三次，背景相当的浓，而且不加beads，只有lysate的管的背景信号丝毫不弱，怀疑lysate里的蛋白自身磷酸化，而且洗不掉，粘在管壁，加loading dye后加热后就掉下来，电泳，干胶，自显影后背景很浓，郁闷中！ 请大家帮我想想办法！

• xue258 (2014-5-31 09:15:32)

  吸附是因为疏水相互作用吧,加点吐温或者triton试试，硅烷化只适合玻璃,没听说塑料可以.

• 水母 (2014-5-31 09:15:51)

  0.1%的triton，or sds，甚至1％sds都试过了，背景都很浓，现上传一张图片！这个gama－p32－ATP很贵，哎，用起来压力大啊！大家帮帮忙！万分感激！

  
  99159397.jpg

• 水母 (2014-5-31 09:16:39)

  
  我要的目的条带很短，箭头所示！ 但是这个background is so heavy.这个蛋白是GST融合蛋白，其实是个短肽，我们研究磷酸化位点的！

• zhenxin (2014-5-31 09:17:01)

  
  非特异蛋白在Beads上，不再管子上。
  beads 封闭了吗？
  即使封闭，也会有很多非特异结合的, 细胞内的激酶活性使许多蛋白标记上了p32ATP ，实验设计有点问题。
  降低背景的方法：
  1. 优化beads的封闭条件
  2.将最后的洗脱液用离心超滤（1.5 ml 或0.5ml ，有售), 初步分离一下，在检测。
  3. 优化激酶的反应条件，可以减少一些p32ATP的用量，调整一下ATP与 p32ATP 比例；其他的升华条件等等
  

• 水母 (2014-5-31 09:17:20)

  
  1，奇怪的是没有加beads，只加lysate和其他反应成份的管里也出现了很强的背景，而且这个对照也是同样wash三次的。
  2，我没有洗脱啊，利用beads连着我的substrate，通过离心，洗这个beads，及洗掉反应体系里面剩余的hotATP.
  3, ATP和hotATP的比率不知道怎么调节，有没有经验值？我这里的hot ATP所剩很少了。我看paper及protocol上讲ATP终浓度100umol，我用的不到这个浓度，HOT ATP加得比较少。谢谢你们！
  还有建议么，我很急啊！谢谢!!!!

• sunnyB (2014-5-31 09:17:38)

  
  1. 电泳前，要把substrate和beads 分开吗？ 如何分开呢？你说：“加loading dye后加热后就掉下来” 正式洗脱啊 。这样地洗脱，能保证只有substrate，没有beads上其他的被磷酸化的protein 掉下来吗？一般这种洗脱方式，所用在Beads上的分子全都会下来。
  2 即使管子吸附蛋白也不妨, 移到新管再煮beads，保证蛋白100%来自beads.
  3. cell lycyte 成分复杂，细胞内的激酶活性使许多蛋白标记上了p32ATP ，而不只是你的底物。即使封闭beads, 这些带有p32ATP的产物蛋白，还是会少量的非特异的结合到beads上，而放射自显影非常灵敏，这就是胶上看到的大分子量的信号。
  3 我又仔细看了一下帖子，你封闭beads了吗? triton，sds，要在封闭Beads的前提下才有用。用高浓度BSA封闭（5%）（如果BSA不被磷酸化，在你的实验中），会相对降低你的背景。
  4 有其他方法切下你的底物吗（如酶法，竞争洗脱，或条件洗脱）？那将是最好的办法：如果只能煮，BSA封闭后效果也不好，那就只能想办法把你的
  substrate 同其他蛋白分开，再作自显影。
  5 hotATP比率倒不是最重要。可以参照文献。
  

• 水母 (2014-5-31 09:18:14)

  谢谢楼上中肯的意见！
  我之所以没有事先洗脱beads上的substrate是想借助beads wash我的反应产物，将lysate里的其他成份，以及多余的hotATP都洗掉，然后loading dye洗脱电泳，可是感觉很多自身磷酸化的蛋白黏在管壁和beads上，现在正考虑将beads换管的做法。
  实验中我没有封闭beads，如何封闭呢？BSA我这里有。
  谢谢！

• sunnyB (2014-5-31 09:18:35)

  
  你的实验中应设一对照：只用beads+ cell lysate,。
  我做过同样的实验，请一定封闭beads, 否则还有许多杂蛋白。
  在连上substrate后, 加3%-5% BSA ，孵育30 分。（选合适的buffer和温度）
  洗3次，再作反应。