【求助】sds-page浓缩胶的凝固

最新回复

• yes4 (2014-5-31 10:36:18)

  
  可能是混合时没混匀，还有就是可能操作太慢，未铺胶时已凝！！！

• birdfish (2014-5-31 10:36:40)

  
  混合：摇晃了几下烧杯，在加样时又用枪头打匀了一下下
  在加入temed后马上灌胶，操作时间不超过3分钟
  继续加样时枪头已打不出液体，烧杯中的胶有一部分已凝，另一半却未凝

• orangecake (2014-5-31 10:37:00)

  
  降低AP和TEMED的浓度试试

• fei1226com (2014-5-31 10:37:21)

  
  换个配方吧，参考《蛋白质技术手册》上的。
  如果你的试剂没问题的话。

• 2541 (2014-5-31 10:37:40)

  
  恭喜你,你的试剂都不错,把AP浓度降低到原来的二分之一或四分之一试一下,尽量在稍低的温度下灌胶,实在不行在冰盒上配胶,再灌胶.

• 04906 (2014-5-31 10:38:07)

  
  我曾经看过一个帖子，AP是主要的催凝剂，而且加AP和TEMED的顺序应该是先加TEMED后加AP,我是先加TEMED后加AP的没发现先凝的情况。祝楼主好运！~

• jujuba (2014-5-31 10:38:27)

  
  给你一份我的配方，我用着很好，你可以试一下。
  ddH2O 5.5ml
  30%丙烯酰胺混合液1.3ml
  1.0mol/l Tris（pH6.8）1ml
  10%sds 80ul
  10%ap 80ul
  temed 8ul

• boom (2014-5-31 10:38:49)

  我都是参考Takara上面的配方来加的，也出现过你这种问题，我当时分析是因为上层胶里本来TEMED量就不小，而且我当时拿来配胶的烧杯刚从烘箱拿出来，温度可能有点高，不知道你是不是同样情况。上层温度高时的确凝结很快，要抓紧时间操作。

• jujuba (2014-5-31 10:39:07)

  
  楼主的配方应该没问题，而且现在气温并不高，这种APS 和TEMED 的量在夏天加也不应该这么快凝固，还是认为主要可能是配完胶后没有充分混匀，，一般摇动混匀加用枪反复吹匀应该没问题，还有检查下你的APS 配置有无问题，及你的烧杯是否温度高，楼主可详细说明下你的配胶方法。再作具体分析。

• yapuyapu (2014-5-31 10:39:48)

  实验新手：做sds-page的时候，分离胶没问题，但是浓缩胶却在加样时就一半开始凝固，一半未凝固。己加进去的也不均匀 ，折光度不一样。
  5%浓缩胶配方：
  ddH2O 3.4ml
  30%丙烯酰胺混合液 830ul
  1.0mol/l Tris（pH6.8） 630ul
  10%sds 50ul
  10%ap 50ul
  temed 5ul
  是分子克隆上的5ml体系，不知识哪方面的问题，望各路高手赐教！
  ......
  
  ==============================================================================================================
  
  我认为的原因及解决方案
  原因：AP在TEMED催化的条件下效率太高引起的（你AP/TEMED效率太高）。虽然你分离胶聚合很好，但聚合速度一定也很快。（温度及混匀的影响都不会这么大）
  机制：
  TEMED催化AP产生大量自由基，自由基催化丙烯酰胺－－甲叉双丙烯酰胺反应聚合为凝胶。在不加TEMED前这个反应相当缓慢，一旦加了TEMED则迅速加速。
  解决：
  根据个人对凝聚速度的要求以及各个实验室使用的试剂效率不同（我呆的实验室发生过换试剂以后类似的现象），可以人为调整AP和/或TEMED的用量。建议以1/2为梯度降低AP和/或TEMED的用量，摸到一个最佳效果以后再做胶，不要担心没按配方，不影响你的后续。

• birdfish (2014-5-31 10:40:14)

  
  多谢各位的相助!!
  我现在制的胶已经没有问题了,还是一样的试剂和配方.只是把TEMED在APS之前加.
  我推断以前出现问题的原因可能是没有通风橱,加TEMED的过程有些慢,而此前加入的APS已经在催化了,而且没有混匀.
  不过跑的胶却有一个很奇怪的现象.我师兄用酵母表达的蛋白,在透析后和我的一起跑,他的带向右偏离出了胶,包括旁边的marher,我的带隔的较远,是正常的.
  不知道又是因为何故?
  测过他蛋白的pH,6左右

• c86v (2014-5-31 10:40:31)

  
  我把槽放入冰箱了……竟很有效果

• dragonkilly (2014-5-31 10:40:47)

  
  TEMED,APS哪个先加哪个后加无所谓,TEMED是加速剂;APS是催化剂,这两个不加体系反应就非常慢,而且这个体系有热催化的效果,低温下放很久都不会凝的,如果有用核黄素催化的,放在强光照下就聚合的快.

• dragonkilly (2014-5-31 10:41:24)

  
  中了page的毒:
  师兄用酵母表达的蛋白,在透析后和我的一起跑,他的带向右偏离出了胶,包括旁边的marher,我的带隔的较远,是正常的.
  不知道又是因为何故?
  测过他蛋白的pH,6左右
  是从下面出去的还是从侧面一边出去的?
  如果是从下面,可能是电泳槽内部的液面不够高,造成电流分布不均匀.
  如果是从侧面,估计是胶的该边缘进了电泳缓冲液,侧面形成通路.
  

• duoduo (2014-5-31 10:41:42)

  
  如果同一块胶上电泳条带不同，应该是加样问题吧

• mercedes (2014-5-31 10:42:00)

  每次都是从侧面出去的
  并且,会影响旁边的带
  我自己的样隔了2个泳道,以及后来都跑的挺好的

• yueban-1147 (2014-5-31 10:42:17)

  
  有些人做浓缩胶时会用水覆盖 ，千万不要这样啊！这样就会一半凝了，另一半不凝！