【求助】菌液上清碱性蛋白酶纯化：阴阳离子层析目的...

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• hot_hot_hot (2014-5-31 11:26:55)

  QUOTE:

  原帖由 biabiade 于 2014-5-31 11:26 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  各位高手：目的蛋白酶80%饱和硫酸铵沉淀后，溶于20mMpH7.0的Tris-HCL，同样的缓冲液透析后，上离子交换层析，平衡液为20mMpH8.0的Tris-HCL，100~1000mMNaCl 分步梯度洗脱,目的蛋白绝大多数在穿过液中，阴离子交换层析中100mM、200 ...

  1. 你的透析外液检测离子氨离子浓度了吗?怀疑是你透析的不彻底,使的目的蛋白挂不上.
  2.建议你用平衡液透析
  3. 你蛋白的等电点大概是多少?如果不知道,可以先做静态吸附,预实验后再选择用阳柱还是阴柱!
  4. 阳离子填料用pH=8的平衡液恐怕不合适!
  

• biabiade (2014-5-31 11:27:12)

  1.没有检测过铵离子浓度。不过后来用上清超滤液直接上阳离子交换同样不吸附。
  2.PI未知。请问什么是静态吸附？怎么做？我准备按照Current protocals of protein science 中所说的做pH和Nacl以及蛋白浓度的预实验。你看有必要吗？
  3.是根据一位老师的建议。我也觉得不太合适。阳离子交换缓冲液没有用Tris-HCl的呢。那用什么好呢？
  ４．有的文献说pH 预实验最好用GOOD缓冲液，您觉得呢？

• hot_hot_hot (2014-5-31 11:27:37)

  1.阳离子交换同样不吸附,我想是和你蛋白的等电点有关,而且显然你的阳离子填料用pH=8的平衡液不合适。
  2.关于静态吸附你可以看看相关的蛋白质纯化的书籍,一下子也讲不清楚
  3.GOOD缓冲液和应该都可以,只要能提供稳定的pH就可以,无所谓什么.

• kuohao17 (2014-5-31 11:29:00)

  透析和超滤用于蛋白脱盐都不是很好，个人建议先采用G25等脱盐。
  如果你要摸索蛋白纯化条件，静态吸附是可以，另外也可以采用pH5时阳离子交换，和pH9时阴离子交换来做，从而确定你蛋白可能的pI区间，再优化条件，阳离子交换建议采用Na+系统，阴离子交换采用Cl-系统

• biabiade (2014-5-31 11:29:19)

  纯化新手上路，请勿见笑。Smile
  1.不知道你们所说的静态吸附是否和Current protocals in protein science 中的Test tube pilot experiment to determine starting conditions for ion-exchange chromatography 一样。
  2.能否把静态吸附相关protocals发到我的邮箱里？thanks a million.我的邮箱：vivian20088@163.com.
  3.给我推荐基本较好的纯化方面的书籍好吗？适合向我这样的入门者的。中英文都行。
  4.再次感谢你们的热心相助。

• kuohao17 (2014-5-31 11:29:39)

  对的，静态吸附就是用EP管做不同pH结合和洗脱的
  理论上我一般看看protein method，但我没电子版，有印刷版的

• qhyu (2014-5-31 11:29:55)

  
  我也是新手，我有一点建议：从“目的蛋白酶80%饱和硫酸铵沉淀”开始到上柱前都应该跟踪目的蛋白酶的活性并定量，事先可以向上面战友说的做一下静态试验，看一下吸附（缓冲液PH、浓度）和洗脱（盐浓度范围）的大概范围条件，包括阴离子和阳离子柱。这样得到大概范围后就可以着手深入研究了。另外，我觉得透析也是一种很好的脱盐方法，但是要注意目的蛋白酶与透析材料要没有反应的哦！

• zwsyrt (2014-5-31 11:30:11)

  
  其实不用做什么静态吸附了，如果你的蛋白溶解性好的话，在盐沉淀复溶后，先检测一下你复溶液电导，电导不测就做离子吸附恐怕欲速则不达啊，最好是用G25脱盐，然后用弱酸或碱来滴定就可以初步知道你的目的蛋白的实际PI的范围了．然后再上柱摸索条件

• biabiade (2014-5-31 11:31:40)

  1 弱酸或碱来滴定就可以初步知道你的目的蛋白的实际PI,第一次听说,楼上的朋友讲来听听?PI反应的是蛋白带电荷与pH的关系,可以用弱酸或碱来滴定确定?难道是加酸碱然后测电导吗?这样好象也不是很准确哦.
  2 用G25脱盐,如果样品多还可以,如果不多,怕是找都找不到了,实验摸索条件小样最好,用透析会简单而快洁
  3 静态吸附很快,一个下午就可以将条件摸索出来,如果蛋白质性质不知道,做静态吸附应该是最快最省事的办法了

• biabiade (2014-5-31 11:32:26)

  透析和超滤用于蛋白脱盐都不是很好，个人建议先采用G25等脱盐。
  如果你要摸索蛋白纯化条件，静态吸附是可以，另外也可以采用pH5时阳离子交换，和pH9时阴离子交换来做，从而确定你蛋白可能的pI区间，再优化条件，阳离子交换建议采用Na+系统，阴离子交换采用Cl-系统
  
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  1. 透析和超滤用于蛋白脱盐都不是很好，不是吧,超滤脱盐浓缩已经用在了大生产上,透析我们实验室在用,就做阴柱,挂样没有一点问题,应该是很经典的方法.个人认为,小样还是用透析.只要注意温度就好.勤换液
  2 阳离子交换建议采用Na+系统，阴离子交换采用Cl-系统 ,Na+系统还是Cl-系统是因为二者的洗脱强度介于中间,如果很小的浓度就能洗脱或者很大的浓度才能洗脱,那旧应该考虑选用不同的强弱的离子,弱的如:醋酸,强的如:柠檬酸

• biabiade (2014-5-31 11:32:54)

  
  非常谢谢各位朋友不吝赐教。
  1.这段时间由于忙着测序的问题，还没有作预实验。
  2.等我制订好预实验计划，再上传给大家帮我审阅。
  3.如果哪位朋友有自己的实验细则，麻烦请传到我邮箱好吗？拜谢。