【求助】western blot 中跑胶考染后发现条带弥散?

最新回复

• zbboom (2014-5-31 13:47:32)

  
  跑完后有没有马上把胶从电泳buffer中取出呢？？如果在没有电压状态下置于电泳buffer中，胶上的蛋白就会弥散。

• iii_ii (2014-5-31 13:47:51)

  
  是马上取出来的 然后就染的
  ????

• zhenxin (2014-5-31 13:48:08)

  
  这种情况我们实验室遇见过，是因为胶凝的不充分不均匀导致蛋白弥散。胶要充分的凝固，我们是放在恒温37度至少半小时；再想一想AP的配置时间是否过期了，引起胶凝固的不充分；加样后是否立即加电压跑电用，如果加样时间长而没有跑电泳，也会出现蛋白弥散。个人见解！祝好运！！！

• 8princess8 (2014-5-31 13:48:26)

  
  我觉得：1、凝胶凝固的不够充分（可能时间不够或者，如果室温较低需要更长时间，还有看看配胶的试剂是不是时间太长了）；2、电极缓冲液是否使用次数过多，一般使用两次就需要，如必要一次一换最好

• 8princess8 (2014-5-31 13:48:44)

  还有如果可以，先固定一下看看

• iii_ii (2014-5-31 13:49:00)

  
  真是谢谢大家!!!
  再请问,AP代指什么呢

• u234 (2014-5-31 13:49:23)

  western blot 中跑胶考染后发现条带弥散?
  是加样量太大了或每个孔道都加样了靠的太近了?
  可后来我大大减少了加样量跑出的条带还是弥散的厉害,跟边上的孔道条带连在一块了
  是不是胶的问题呢?要不要增大分离胶的浓度呢?原因呢?
  不吝赐教!!!
  ......
  
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  不知你说的弥散在纵向上是否也存在。
  楼上的战友推测可能是胶凝固的不充分。也
  可能是其中的一个原因吧。
  我做的经验是，配5ml的分离胶，加TEMED
  5ul,AP 50ul,2ml的浓缩胶，TEMED 2ul,AP 20ml.分离胶
  凝固时间为8-10分钟，浓缩胶5分钟。电泳结果无影响。
  针对你的弥散情况，试试延长蛋白煮沸后的离心时间。
  再有就是稍微加大一下凝胶的浓度。可能会有所改善。

• 8princess8 (2014-5-31 13:49:45)

  
  AP应该说的是过硫酸胺吧（APP）

• INK (2014-5-31 13:50:34)

  
  是不是样品的pH有问题吧，如果偏酸的话，可能会有这样的情况产生。
  胶一定要凝结充分，分离胶缓冲液重新配过试试看。

• kuaizige (2014-5-31 13:50:50)

  
  1 可能是你的PH有问题，检测一下；
  2 你Loading Buffer里和电泳缓冲液里放的SDS足量吗？如果忘记放或者量不够也会出现这个问题；
  3 也可能是你胶凝固的问题，多凝固点时间，上样后马上加电压跑电泳（上样后不马上跑也会扩散）。