【求助】几种蛋白质的归类问题

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• dog002 (2014-6-10 17:45:48)

  路过，光看这写名字也不知道，不过可以跑跑糖蛋白电泳鉴定下的
  不知道方法是不是很笨，如果需要具体方法可以跟帖，我发给你

• dog002 (2014-6-10 17:46:10)

  
  这个是可以直接用实验看出来是不是糖蛋白的方法
  [试剂]
  1、30%凝胶储备液（就是跑SDS那种）
  2、10% AP、TEMED
  3、分离胶缓冲液（PH8.8 ）、浓缩胶缓冲液（PH6.8） （同SDS）
  4、电极缓冲液（硼砂-NaOH，PH9.4）
  5、样品溶解液：40%蔗糖
  6、0.5%溴酚兰
  7、Schiff染色液：5g碱性品红，1L沸水溶解，冷至40度加入6.8g偏重亚硫酸钠和0.1mol HCl，室温后加入些许活性炭至溶液无色透明过滤，装入棕色瓶，4度保存，1周内用
  8、固定液10%TCA、1%高碘酸、0.5%偏重亚硫酸钠
  [电泳]
  开始部分参照SDS电泳，但注意缓冲液用是上面试剂4的。胶浓度可以参照分离胶7.5%，浓缩5%，也可以根据你自己的情况改变啦~~~
  电流参照一般SDS就行
  PS：你做的话要同时做两块胶，对应位置点相同的样，一块用于蛋白染色，一块用于糖染色！！
  [染色]
  1、蛋白染色同一般的染色，考染就行
  2、多糖schiff染色：10%TCA摇床固定15min后ddH2O洗2次，1%高碘酸处理15min，摇床中水洗5min*3次，加schiff试剂室温避光染色30min，倒去染色液后用0.5%偏重亚硫酸钠洗胶5min*5次，至此应该可以看到多糖条带
  最后对比两蛋白染色带和多糖染色带，同时被染色的就是糖蛋白了。

• applebook=213 (2014-6-10 17:46:32)

  样品溶解液为什么用40%蔗糖？
  蔗糖不就会干扰结果吗？还是蔗糖不会随样品一起向下走？

• applebook=213 (2014-6-10 17:46:49)

  7、Schiff染色液：5g碱性品红，1L沸水溶解，冷至40度加入6.8g偏重亚硫酸钠和0.1mol HCl，室温后加入些许活性炭至溶液无色透明过滤，装入棕色瓶，4度保存，1周内用
  
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  我配的Schiff染色液加了活性炭后还有浅浅的棕褐色，这是什么原因？
  另外我用此方法染色时候，在Schiff染色后不加偏重亚硫酸钠漂洗就可以看见淡淡的条带，漂洗后条带颜色变化也不大，总是很淡，这是什么原因？
  谢谢！

• applebook=213 (2014-6-10 17:47:10)

  
  这里加蔗糖到样品缓冲液应该也是和SDS中的加甘油是同一个作用的，有些地方是介绍加甘油的，我手头上的资料是用蔗糖，我就这么写给你了。而且糖不会对结果有太大的影响。
  另外你说加活性炭后还有棕色，是不是你加的活性炭量不够啊？你加了多少？？我之前做没有出现这样的情况哦
  漂洗是为了把胶洗干净的，可以用甲醛来进行检验的，就是你用偏重亚硫酸钠洗了以后滴加甲醛到胶上如果不变色就表示洗干净了。
  至于颜色很淡，会不会和你上样量有关。

• applebook=213 (2014-6-10 17:47:35)

  
  我回查了下资料，蔗糖就是和甘油一个左右的，增加样品比重的，就是让它好沉到加样孔底部的
  还有，多糖染色后应该呈紫红色的
  祝你好运~

• applebook=213 (2014-6-10 17:48:13)

  我跑出来了，但是有些问题，本来Marker有6条带，可是结果考染好象只看到5条清晰的条带，在分离胶顶部隐约有很细的一个条带，不知道这是不是96kD的条带，我跑的是SDS-PAGE 12%的胶。
  PAS染色能够看到四个条带，跟考染比照是下面的四个条带，也就是说可能是Ovalbumin, chicken egg； Carbonic anhydrase, bovine erythrocyte；Trypsin inhibitor, soybean；bovine milk α-Lactalbumin 这四个是糖蛋白。
  因为其中chicken egg Ovalbumin的条带处拖尾现象很明显，我前些天看到资料说糖蛋白会有拖尾现象。而我查到的资料知道chicken egg Ovalbumin（鸡卵清白蛋白）是糖蛋白。