【求助】求助向各位高手请教双向电泳技术

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• 68943512yao (2014-6-11 16:39:37)

  
  看来我比你幸运多了，我去年做了半年蛋白的电泳，今年刚做了几次双向，稍微积累了一点经验。
  个人认为，实验不可操之过急，磨刀不误砍柴工，先查一些相关资料，这方面园子里挺多的，要对双向有一个初步的了解，对可能发生的问题有一个大概的预测，不可盲目去做，实验准备的好，可以起到事半功倍的效果。
  双向最重要的是前期的样品的制备，要是样品制备的好，那么后面的问题就相应要好解决多了，另外比较重要的是一向结束后胶条的平衡、胶条向二向的转移和最后的染色。解决了这几个问题，实验就成功了一半，五个月应该没有问题。

• wmp1234 (2014-6-11 16:39:56)

  
  我建议你还是先跟着熟悉的人看看 你的试验应该做的顺利的话很快就做完了，估计一个月 左右 跑双向电泳 前提是提取蛋白质的方法和裂解蛋白质技术有现实参考的 蛋白质定量试剂盒 定量检测 一向 二向参数有参考依据 不过细菌好做 染色方法现成 后面的上质谱技术最好看看生物质朴的建议 如果你这些都有人愿意带你做的话 我估计你如果样本不多的话 2个月做完取质谱数据 一切OK 最后就查质谱数据库 MS-FIT cuturl('http://prospector.ucsf.edu/')或者 MSCOT cuturl('http://www.matrixscience.com/')
  就基本完成了 最多有新蛋白的话 可以往下面做功能蛋白质组学研究 蛋白质鉴定等 我还建议你可以很多资料在丁香园里面也可以找到参考的 比如染色技术 电泳条件 一向 二向参数

• orangecake (2014-6-11 16:40:18)

  我还在做SDS-PAGE，二向电泳还没接触过呢，不知道如何下手，也急呀！！

• finger (2014-6-11 16:40:38)

  
  我也是一样，目前为止，我只作过SDS-PAGE，希望能得到更多的技术支持．

• zranqi_1 (2014-6-11 16:50:45)

  
  谢谢各位指点。其实我遇到的问题还很多，做这个需要很多money，对吧？可我老板根本没钱，我想知道这个试验就最少的预算来说需要多少钱？是不是IPG胶条是这个实验中最贵的？有多贵？其他药品买下来大概要多少钱？哪位能给我一个较详细的答复最好。我觉得我们老板根本就没做过预算，只是想当然的用2D技术，他可能想往科学前沿发展，但是什么都没个打算，所以我只有靠住大家让我了解一些这方面的情况了，然后我再给老板汇报，要是他做不下来就得赶快想办法了，我现在急得哭都哭不出来了。我的问题很愚蠢，希望大家不要见笑。

• DONT (2014-6-11 16:51:10)

  
  2D的成本比较高，首先是最贵的IPG胶条，大概每根在１０美圆左右，具体的人民币的价格得看你去的代理公司了，每个公司的汇率也是不同的．一般是１２根一套．价格还是挺吓人的．还有一些要求比较高的药品，水化上样，平衡的药品最好使用进口的，效率比较有保证．至于成套的电泳设备的价格就不知道了！在BIO-rad或者安马西亚的网站应该有介绍！最好能用合作实验室的．还有比较贵的东西就是蛋白点的质朴分析了，那价格是相当贵了！现在也得小一千一个质朴分析结果．至于时间上，５个月如果有人帮忙的话应该足够了！祝你好运拉！道路是曲折的，前途是光明的！

• zranqi_1 (2014-6-11 16:51:32)

  
  谢谢，有了各位的帮助我不再感觉绝望了，好像从新看到了光明，就算是实验做不下去我还是感觉这里真好，言语已经无法表达我对你们的谢意了，再次谢谢了！电泳设备我老板找地方用，只是技术没人会，我明年五月就得定论文稿了，所以很急，有了大家的鼓励，我已经不是那么的怕了。我给我老板汇报一下情况，看他的态度了。我还会随时上来请教大家的。

• yonger (2014-6-11 16:52:02)

  
  1、花费：其实我们实验室算过一个固相2D的成本大约280元一张胶图片下来就够了，前提是一部分用SIGEMA进口分装的试剂，其它的能用国产的也可以了。一次2D电泳下来大约用到以下试剂Sad你可以查看一下价格)：
  （1）尿素、丙烯酰胺、N,N-甲叉双丙烯酰胺、十二烷基磺酸钠（SDS）、过硫酸铵（AP）、Tris、甘油、硝酸银、甘氨酸、矿物油（北京鼎国）；
  （2）硫脲、二硫苏糖醇（DTT）、3[（3 胆酰胺丙基）二乙胺]丙磺酸（CHAPS）、碘乙酰胺（IAA）、四甲基乙二胺（TEMED）、（ Sigma 公司产品，USA）；
  （3）蛋白marker、低熔点琼脂糖、溴酚蓝、甘油；
  （4）硫代硫酸钠、无水碳酸钠、无水醋酸钠、无水乙醇、冰醋酸、甲醛、甲醇、正丁醇等为国产分析纯；
  （5）IPGstrip ，IPG buffer。
  2、时间：其实最重要的还是样品制备。如果你的样品没有问题，以后的工作就简单了，另外如果别人没有做过，你在第一项聚焦程序上可能要摸索一些时间，第二向现在的技术都很成熟，问题不是很大。（我们实验室一个师弟从接触到完成用了不到一个月就跑出来10张很不错的图谱，当然一些技术条件是参照我们摸索出来的方法）。所以刚开始做还是要看看别人现场怎么操作，系统的看一次胜过看好几遍书，毕竟看会形象些。
  3、其它一些建议：其实你如果时间紧，一开始做就要考虑你将来是不是要作质谱鉴定。要做的话就要考虑上样和银染尽量能质谱分析兼用。因为时间有限。
  4、另外一张胶一般用两天搞定！还有图谱分析液很麻烦！
  我这边有一些双向电泳的资料，和分析软件的说明书等！如果需要的话可以联系我！
  【2D_Platinum_簡易操作手冊.pdf(2.46M) ；2DE_chinese_workshop_manual.pdf(187.37K) ；ImageMaster中文手册.pdf(6.7M) ；BIO-RAD双向电泳培训（资料）.doc(310.39K) 】
  祝工作顺利！

• zranqi_1 (2014-6-11 16:52:21)

  非常感谢了，你给我了一个很有价值的回答。我这几天正在整理试剂以及费用的信息，如果老板非得做下去的话，那我以后只能在这里请大家给我一些技术上的指导了。我的试验中有很多无法想象的艰辛，但是很高兴有了你们的帮助。

• wawa (2014-6-11 16:53:00)

  需要根据材料而定吧。如果做体液的双向电泳，蛋白点很少，但并不是失败的。如果你做细菌的双向电泳，点应该不会少吧。双向电泳的重复性较差，我们二向时用DALTtwelve，一次跑12块胶，觉得效果还好些。
  我从本科毕业就看师兄作了一年，感觉如果要摸条件，先跑7CM小胶，用考马斯亮蓝染色。熟悉操作后再作18CM或24CM大胶，如果满意再银染不迟。分子克隆系列丛书有本蛋白质组学实验手册，还有Amersham网站上的手册都很有参考价值的，当然特定的实验环境也需要根据自己实验室的环境做一些改动。我觉得5个月能掌握这项技术，前提最好是老板有钱。祝你好运。

• zranqi_1 (2014-6-11 16:53:28)

  
  谢谢了。我现在还没有摸过电泳仪器呢，所以一点经验没有，就连看还没看过呢，完全得自己摸索了，我倒也听说过先用小胶条，我也知道胶条及试剂特别贵，不知老板肯不肯出钱了。老板出去旅游了，我只能等他回来说这事，很是郁闷，真着急。大家都给我提了不少的好意见和建议，我很感谢大家，我想最主要的还是得要有人在身边指导更好，我就没你们幸运了啊。我也祝你们事事顺利！

• ero11 (2014-6-11 16:54:04)

  广州这边质谱分析在中山大学测试中心可以做，不过分子量太高的话可能他那里做不了，我以前也问过那边，因为当时我的样品分子量在15kD左右，中大测试中心那里做不了分子量大的ESI-MS-MS ，我后来在上海生化所做的。价格也差不多。
  祝好运！

• yjf1026 (2014-6-11 16:54:34)

  其实如果全部都自己配溶液，用国产的双向电泳产品，花费会大大减低的，胶条自己做就省不少前，不过学习灌IEF胶条和脱IEF胶条都是比较郁闷的事，得在正式前多加练习
  实在缺钱就自己动手吧，不算电泳仪，药品+电泳槽大约需要2000吧，可以跑不少了，好运啦

• zranqi_1 (2014-6-11 16:55:03)

  
  听楼上的说来，自己动手作胶条已经很省钱了还需要2000，那要是自己买IPG胶条岂不是更贵？唉.............老板到现在了还不说让我开始作电泳，都这时候了，希望有条件的同学一定要珍惜啊，郁闷自己，羡慕你们！

• 蒲公英 (2014-6-11 16:55:23)

  
  搭车问一下：
  提细胞的总蛋白时，其裂解液里不需要DNase和RNase吗？

• zranqi_1 (2014-6-11 16:55:44)

  实验室电脑坏了一个月了终于好了，呵呵。我的2D实验还没有开始，不过我经常来看看大家的，顺便向大家学习