【求助】sds-page 问题多了，急啊~~

最新回复

• huifeng0516 (2014-6-12 17:04:41)

  1 我用的也是六一的.前一段时间电泳时间大约5小时,后来不知道为什么缩短到2小时了.
  2 我的预染marker刚开始时还不错,但是跑一会后就越发弥散. 汗啊
  3 上样缓冲液最好加DTT.你加5被buffer的目的如果不是为了提高蛋白浓度的话,最好使用2被buffer
  我也在实验室坚持western,食堂关门了.整天面条.
  兄弟们好辛苦啊

• am10 (2014-6-12 17:05:03)

  
  呵呵，看来我们的食堂比较人性话
  建议上样缓冲配成2X的，临用前家DTT。
  另外可以检查下配胶时用的两种TRISCL的PH。这个好像非常关键
  可以观察一下电泳时的电流大小
  国产的电泳仪用起来非常麻烦

• zhezhe (2014-6-12 17:05:26)

  
  电流一般都是在20-30ma左右，tris.hcl ph我仔细的调了，甚至担心我得ph计有问题，还换了一个调的。应该是对的了。

• avi317 (2014-6-12 17:06:48)

  估计电极缓冲液有问题,我也有类似经历,换了新配的电极缓冲液,效果就好了.

• fei1226com (2014-6-12 17:08:12)

  
  电极缓冲液的PH不用调。tris；甘氨酸；SDS三者按比例配好就行了，用时稀释到1×即可。
  我觉得是配胶时tris-HCl的PH不对。浓缩胶用PH=6.8的；分离胶用PH=8.8的。

• 831226 (2014-6-12 17:08:46)

  
  我的loading buffer是2*的，自配的。在配置时，我适当加了溴酚兰和甘油的量，感觉还不错。

• fei1226com (2014-6-12 17:09:36)

  我的方子，你核对一下
  2×loading buffer  终浓度  实用  5ml加
  SDS  4%  固体  200mg
  水  3.85ml (PH 6.8 Tris-HCl加后利于溶解SDS，SDS+ DTT增加150ul体积）
  Tris-HCl, PH 6.8  120mM  1M  0.6ml
  DTT  0.2M  固体  155.4mg
  甘油  20%  100%原液  1ml
  溴芬蓝  枪头沾取痕量溴芬蓝加入以达到电泳指示剂的效果即可。
  注  500ul 分装-20℃保存>1年，融化后4℃保存>2周~2月
  5×loading buffer  终浓度  实用  2ml加
  Tris-HCl, PH 6.8  300mM  1M  0.6ml
  SDS- - - - - - - - - - -10%  固体  200mg
  水- - - - - - - - - - -0.85ml (PH 6.8 Tris-HCl加后利于溶解SDS，SDS+ DTT增加150ul体积）
  DTT- - - - - - - - - - -0.5M  固体  155.4mg
  甘油- - - - - - - - - 50%  100%原液   1ml
  溴芬蓝- - - - - - - -枪头沾取痕量溴芬蓝加入以达到电泳指示剂的效果即可。
  注  500ul 分装-20℃保存>1年，融化后4℃保存>2周~2月

• 8princess8 (2014-6-12 18:01:23)

  
  你的甘氨酸使用时间太久了，建议你换一瓶试试

• fsdd817 (2014-6-12 18:01:53)

  
  以下是我试验中蛋白电泳各种试剂的配方，效果一直很好啊！
  SDS-PAGE凝胶溶液和电泳缓冲液
  1．30％丙烯酰胺储存液（100 mL )：29g 丙烯酰胺，1g甲叉双丙烯酰胺，加蒸馏水定容至100 mL，过滤避光保存。
  2．1.5 mol/L Tris-HCl pH8.8（100mL）：18.2 g Tris溶于40 mL 蒸馏水中加入盐酸调pH值到8.8加蒸馏水定容至100 mL。
  3．1 mol/L Tris-HCl pH6.8：12.1 g Tris 溶于 40 mL 蒸馏水中，加入盐酸至pH6.8，加蒸馏水定容至100 mL。
  4．Tris－甘氨酸蛋白电泳缓冲液（5×，1L）：15.1g Tris碱，94g甘氨酸，50mL 10％SDS(w/v)，加800mL蒸馏水，待全溶后定容到1L。
  5．2×SDS上样缓冲液 20mL
  1 mol/L Tris·Cl(pH6.8) 2 mL
  10％SDS 8 mL
  甘油 4 mL
  β-巯基乙醇 2 mL
  溴酚蓝 0.04g
  蒸馏水 4mL
  6．考马斯亮蓝染色液 500mL
  1.3 g 考马斯亮蓝 R-250
  225mL 甲醇
  225mL 蒸馏水
  50 mL 冰醋酸
  7．脱色液 1 L
  100 mL 甲醇
  100 mL 冰醋酸
  800 mL 蒸馏水

• kuaizige (2014-6-12 18:02:16)

  配方没有多大问。
  用2X和5X的应该是一致的。我个人觉得用β-巯基乙醇比DTT好些。但没有用的碧云天的预染marker，不知道你怎么处理的？
  1.我用过与你一样型号的电泳槽，液做过10％的胶，但我电压100V浓缩，150V分离。还用过更大电压。这个对结果应该影响不太大，只是时间长短。
  2.用2X和5X的应该是一致的。我个人觉得用β-巯基乙醇比DTT好些。
  3.没有用的碧云天的预染marker，不知道你怎么处理的？你选择的marker与胶是否匹配，marker分子量太小，你胶浓度太大，marker跑出去了。
  4. 发现上电泳槽的缓冲液跑到快结束时全变浑了，好像有盐一样的东西析出来。可能是SDS被析出来了。

• kuaizige (2014-6-12 18:02:36)

  
  电泳缓冲液不用调PH，配好后的PH接近8.4。水要双蒸水，不然效果也不好。
  你蛋白质分子量好大？marker的分子量是好多？
  有啥子可以问我，这个我天天都这做。

• IAM007 (2014-6-12 18:02:56)

  
  主要注意两种TRIS的PH 值这很关键，别用PH 计，我们吃过亏，最好用PH 试纸，新的，别用旧的，每次配胶前测一下PH 值；另外我觉得你的RUNNING BUFFER 有问题，一般配成5或10倍的用时用一蒸水稀释就可，我们都这么用的。甘氨酸的作用也很重要，最好用比较新的，再说其用量很大，一瓶很快就用完了，刚开始做最好不要回收缓冲液，我们一般回收内槽液。

• wood533 (2014-6-12 18:03:18)

  
  我有几点小建议:一是选用进口的苷胺酸，二是分离胶和浓缩胶的电压增高些，我平常均用80V（浓缩胶）、120V（分离胶）。你可试一试。

• ritou1985 (2014-6-12 18:03:38)

  
  我也是用六一这个型号的电泳槽，好像是不能压成直线的。我看见别的实验室用伯乐的好像还是很直的一条线，不知道是不是仪器的问题。
  另外点样孔真的是看不清楚的，眼睛超级累的。我的是跑到分离胶的时候成一个个弧形的（小微笑型）。

• wood533 (2014-6-12 18:03:59)

  
  楼上的朋友,前几天我已在做SDS-PAGE.我是将电泳缓冲液放在4度冰箱中的,温度较低,同时在空调房内进行,效果很好.
  另外,样品压不成直线,可能是上样缓冲液保存的时间太长了,以前我也遇到这种情况,我重配了上样液效果就好些了.

• ritou1985 (2014-6-12 18:04:17)

  谢谢，我下午去试试。另外上样缓冲液应该没有问题，因为别的实验室用同一批上样缓冲液，也没有出现我的这种现象啊。