【求助】酵母双杂交中这样的诱饵蛋白是不是自激活？

最新回复

• orangecake (2014-6-17 16:07:34)

  可能有his渗漏表达，你加3AT看看

• bring (2014-6-17 16:07:58)

  
  应该是楼上所说的那样

• yonger (2014-6-17 16:08:17)

  
  我刚准备做酵母双杂交,能否向各位高手请教呢?

• yonger (2014-6-17 16:08:38)

  
  比如, cDNA文库是要自己构建的吗?
  LexA融合质粒要怎么选择?

• one (2014-6-17 16:09:30)

  
  看你用的质粒，估计你用的是clontech system3，宿主菌应该是AH109。
  首先，你要确定一下在转化诱饵质粒pGBKT7-A前，你的空菌AH109是否验证过表型；
  如果验证过表型，那就要考虑AH109的弱HIS3表达了。
  因为bait蛋白内在的DNA结合性质AH109的转化子可能表现出轻微的升高的HIS3的表达。小量的3-AT一般说来足够抑制在SD/-His平板上的背景生长。然而，如果你正就HIS3和ADE2的共同表达进行选择，一般说来在最初的文库筛选时并没有必要抑制HIS3的疏漏。为了优化3-AT的浓度，将AH109转化子铺板于一系列含有不同浓度3-AT（0－15mM，例如尝试0，2.5，5，7.5，10，12.5，15）的SD/-Trp/His平板。用最低浓度的3-AT平板，该平板为一周后仅能长出小的（<1mm）克隆。培养基中有太多的3-AT能杀死新鲜的转化细胞。所以，如果你希望在文库筛选时能只选择非常强的双杂交相互作用，我们推荐在最初的铺板时同时用HIS3和ADE2报告子。（译自clontech Pretransformed Libraries User Manual PT3183-1)

• 3648755 (2014-6-17 16:10:00)

  如果用SD/-Trp/-Leu/-His+适当3AT浓度筛选弱的相互作用，挑取在三缺上生长的克隆，在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade上划线，我发现这样筛选到的克隆在四缺上都能生长，但是后面验证又都是假阳性，说明书上也说三缺上生长的克隆到四缺上划线，能生长就是有相互作用，我发现这种做法假阳性很高。不知道你做的结果怎样？
  请问你是如何确认其为假阳性的？
  
  [ 本帖最后由 3648755 于 2014-6-17 16:16 编辑 ]

• mimili_901 (2014-6-17 16:16:58)

  谢谢，非常感谢各位的帮忙，是这样的，诱饵A存在上面的情况，而B、C不存在这种情况。如果是AH109表现的His渗漏表达，那么其他的两个诱饵B、C却不存在这种情况呢？还有一点，就是对于诱饵A，在SD/Trp－和SD/His－、SD/Trp－His－上长出的菌落大小都一致，而不能在SD/Ade－的平板上生长，请问这是否可以说是诱饵A具有微弱自激活呢？

• caihong (2014-6-17 16:18:00)

  如果用SD/-Trp/-Leu/-His+适当3AT浓度筛选弱的相互作用，挑取在三缺上生长的克隆，在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade上划线，我发现这样筛选到的克隆在四缺上都能生长，但是后面验证又都是假阳性，说明书上也说三缺上生长的克隆到四缺上划线，能生长就是有相互作用，我发现这种做法假阳性很高。不知道你做的结果怎样？
  请问你是如何确认其为假阳性的？
  三缺上得到的克隆在四缺板上划线后提酵母质粒转化E.coli，加Kan仍然能够生长，但是测序结果却是我的诱饵载体，一直都不明白，怎么诱饵载体能在Kan板生长。

• caihong (2014-6-17 16:18:31)

  
  对不起上面那个回复
  我把Amp写成Kan，应该是加Amp仍然能够生长，但是测序结果却是我的诱饵载体，一直都不明白，怎么诱饵载体能在Amp板生长。

• jkobn (2014-6-17 16:18:58)

  说明书上写得可能很理想，我做过之后觉得上面说的那些只能做为参考，不能照着他的去做。
  没有仔细看过所有的帖子，觉得你说的检测自激活有些不妥，应该是是BAIT与另一个载体共转，这样才能验证是否有自激活。
  个人觉得X-beta-Gal去检测阳性很容易出现假阳性，X-alpha-Gal没有用过，查了一下觉得似乎更好用，不过太贵。
  通过自己的实验，我觉得首先在QDO　PLATE上长，然后用3AT（20左右），这样得到的克隆就不会太多了。
  很愿意与大家一起讨论Y2H。
  今天中午的时候刚送了140个去生工测序，想起这两个月的时间真是辛苦。

• laughing妹 (2014-6-17 16:19:22)

  
  觉得你说的检测自激活有些不妥，应该是是BAIT与另一个载体共转，这样才能验证是否有自激活
  是这样的吗？我刚开始做，不是太懂，如果同时转bait和另一个载体，那么有一个载体是不是AD空载体呢？
  不知“基因小子”您是做哪个方面的，可以向您请教一下吗

• xiaohuili1323 (2015-5-14 14:03:14)

  您好，我刚刚开始做酵母双杂，遇到些问题想请教您。。我是用一个bait筛选一个Library，AH109和Y187mating之后涂板。。我本来打算先在二缺+底物筛，再到四缺+底物筛。但是现在涂了二缺的大板子，就很浓，背景一片灰，有的一片蓝，没法挑单克隆啊。。是这个筛选策略有问题还是涂得问题啊？要稀释多少倍涂吗？这可在呢么办啊？望能和您进一步交流，请您赐教。我的qq 799980896,谢谢！