【求助】免疫沉淀遇到不少问题

最新回复

• ukonptp (2014-6-21 09:30:49)

  后考马斯亮兰染色1小时 问题就出在这儿
  在脱色没有多久时（大约30min）还是看到条带的，想着背景太深就脱色过夜了，结果什么都看不到了.我虽然都是用自来水煮沸的热脱色,但你的现象说明染色不足.实际考染至少推荐室温3~4h,如果想效果好可以过夜.不要低于室温3h,否则极易导致染色不足.如果想偷懒,那么可以把染色液加热到50~60度,染色30min左右,我的经历告诉我必室温过夜都要好.
  快快回去重新染色,然后再脱看看.

• skytree (2014-6-21 09:31:12)

  那我再去试试看
  还有一个问题，我想知道脱色过夜时蛋白会不会被洗脱掉

• NBA (2014-6-21 09:31:30)

  
  肯定不会 ,你的脱色液含"45%甲醇，10％冰乙酸，45％水",与固定液基本没有差别,本身就可以作为固定液使用,蛋白不会被洗脱掉,我个人的经验是脱色过夜后条带会很清晰,但有时一些含量低的条带却不见了,可能是考马斯亮蓝被洗脱掉了?!
  但是重新染色后,条带还在.说明蛋白不会被洗掉.

• skytree (2014-6-21 09:32:06)

  重新染了一下，条带是出来了
  但是我想看到的100kD左右目的蛋白没有见到
  此外我觉得Marker染色也比较浅
  请各位高手帮我分析一下，谢谢大家了！

  
  55523385.jpg

• ukonptp (2014-6-21 09:32:27)

  嘿嘿,这个俺就不会分析了,俺没做过IP的分析,烦请IP高手予以解释,俺也开开眼界.

• ukonptp (2014-6-21 09:32:43)

  
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  盲
  楼主,
  你考虑一下有没有洗脱彻底???我想你IP一定用抗体,一般人IgG分子量50~70kd,也不知大小老鼠、兔子、山羊是不是是这么多，估计差不多吧，如果还结合你的蛋白而没有被洗脱倒是可能上移50~70kd的。我也没做过，不会分析。我现在做CHIP，最后是要用SDS和碳酸氢钠溶液洗脱15min*2次以逆转抗体和蛋白的结合。看没人回复挺难过的，所以瞎说了一通。不要当真啊。