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【求助】我的WB为什么总是转膜不上
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我现在正在做关于脂质代谢酶类蛋白表达的试验，包括CPT-1以及PPARa。在蛋白提取过程中，我用了RIPA强裂解液裂解大鼠肝脏组织，想提取总蛋白，来做CPT-1(它是表达在膜蛋白上的)；然后配置低渗、高渗液提取核蛋白PPARa。在跑SDS-PAGE时每次染胶都非常漂亮，但是用100v,2h转膜却始终转不成功，丽春红染色后都是一片空白，只有溴酚兰印迹。请大家帮我讨论一下，我的问题到底是出在提取还是转膜？另外今天加了TAKARA的高分子量MARKER也没有转上，真是晕。操作应该没有太大问题的。大家帮帮我啊，谢谢了！！
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最新回复
49888 (2014-7-01 15:11:54)
你的电转条件是湿转还是半干,如果是湿转,试试变换一下转膜条件,注意一下电转液中甲醇的量,因为它是用来洗脱蛋白上结合的SDS的,而SDS多了很可能就转不上膜.一般甲醇量在15%左右.另外PVDF膜要用甲醇浸透,并且平衡时间一定要够.
docsy (2014-7-01 15:12:16)
谢谢，我用的是湿转。转膜前是用甲醇活化PVDF膜。我得 电转液是5*电移缓冲液200ml，甲醇200ml，600ml蒸馏水。这样还是转不上。
docsy (2014-7-01 15:12:48)
8princess8 (2014-7-01 15:13:21)
1。"在跑SDS-PAGE时每次染胶都非常漂亮"，说明电泳没什么问题。
2。“实验室其他人用的同样的电转液都能转上",说明电转液没问题。
3。“TAKARA的高分子量MARKER也没有转上“，说明问题的确出在转膜上。
4。“100v,2h转膜“，时间、电压都没问题。
4。“转膜前是用甲醇活化PVDF膜“，膜处理没问题。
结论：
1。转膜电极反了，我也干过那样的事，当然转不到膜上。
2。转膜是否在低温下进行？
docsy (2014-7-01 15:14:04)
我们的电极是颜色对应，不会错的。而且是在冰中转膜的。你们认为我的蛋白提取会不会又问题？
zsxan1990 (2014-7-01 15:14:34)
我们实验室现在也出现了这样的问题,小分子量的能转过去,但是大分子量的蛋白转不过去,立春红染色也只能看到电泳泳道,看不到蛋白带,是不是SDS有问题呢?条件和实验操作步骤我认为没有问题,我实在想不出问题出在哪里了,
请问,SDS对整个实验过程影响有多大?
flower-201 (2014-7-01 15:14:54)
1.是不是电极弄翻了
2.可能是转膜时间有点长
3648755 (2014-7-01 15:19:13)
我倒是觉得你的样品制备出问题了......
bamboo16 (2014-7-01 15:19:59)
内部短路的话，胶上的marker应该继续存在的吧？？？
wmp1234 (2014-7-01 15:20:22)
看看你的膜有没有问题？
是不是膜已经不好用了
换一换其它的膜试试。
既然转不上去，那肯定就是有问题存在
我觉得楼上的各位都已经分析到了，你再对着认真看看，再重新做一遍，注意每一个小细节。
一定会做出来的。好运。
hold住 (2014-7-01 15:20:49)
1. 转膜时间是否太长了，有可能蛋白已转到PVDF膜背后的滤纸上，甚至缓冲液中了，我们转膜的条件是80伏，1小时。
2. 内部短路了，胶碰到了膜后面的滤纸，电流大部分绕过膜走了，当然转不上。
查找原因的办法很简单，转膜结束后，将膜和胶分别用丽春红和考马斯亮蓝染色，在膜没上色的前提下，如果胶上有条带，说明是短路了，楼主可参考分子克隆中关于转膜过程中如何避免短路的操作规程解决问题，如果胶上也没有蛋白条带，说明是（当然电极接反了也这样）转膜时间太长了，楼主只要缩短转膜时间或降低转膜电压就可以了。
......
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楼主用的是湿转的方法，并不是半干，不会出现“内部短路”的问题。
在半干转时，胶是不能碰到膜后面的滤纸的。
kuaizige (2014-7-01 15:21:10)
呵呵，我的是半干转，已经有两次都是转了部分蛋白（预染marker为证），结果用考马斯亮兰染色，胶上的条带还很浓的，但是在这两次之前都很好，有战友建议气泡没排尽，时间不够，调整之后还是只转上一部分，怎么回事？
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