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【求助】这算是包涵体吗？？

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2014-7-02 10:41    作者: orangecake    来源: 分析测试百科网

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【求助】这算是包涵体吗？？

目的基因999bp，40度下1mM IPTG诱导4h，收集1mL菌液加入100μL SDS-PAGE的loading buffer，变性5min，离心，上清20μL 上样。电泳结果如图。目的蛋白似乎是表达了，大小基本也对。约38KD左右，可是第二天再把前一天变性后剩下的样品再上样跑胶就看不见条带了，不知道大家有没有碰到这种情况，而且，这个重组蛋白很奇怪 ，只能用重新转化的菌做才能表达，而把保存的菌再摇起来就不表达了。请大家帮我看一看，我实在不知道为什么会这样？？有人说可能是包涵体，可是论坛上说包涵体在SDS-PAGE loading buffer中会溶解。
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  • orangecake (2014-7-02 10:41:39)


    1、2、3为空质粒，1为无诱导；4、5、6为重组质粒，4为无IPTG诱导。箭头指向的就是重组质粒表达的蛋白。

  • dog002 (2014-7-02 10:42:29)


    我觉得是因为重组蛋白表达量太低了，20ul的上样量已经够多了，可是从你的SDS-PAGE图上看目的蛋白的条带太浅了。本来重组蛋白就很容易降解，再加上表达量低，这很可能是第二次电泳看不到目的条带的原因。
    增加表达量是你现在要做的，从温度和IPTG的诱导浓度着手，温度可以从37到40调整，IPTG可以用2，3，4mM。还有就是诱导的时候，培养液的体积最好是保持在容器的1/5以下，以使细菌有充分的空间交换代谢物。
    用沸水的方法变性蛋白的时候，包涵体是可以溶解的。

  • glass (2014-7-02 10:43:55)

    选择40度有什么说法吗？

  • kuaizige (2014-7-02 10:44:33)

    可能表达量太少，我觉得到不是因为降解的原因，除非菌体在胞内一边诱导产生蛋白，一边自身降解，但这种外源蛋白的降解情况可以通过形成包涵体的方式来避免，形成了牢固稳定的包涵体后是不会降解的，至少不会这样迅速的降解，这个概念要清楚。
    如果想要可溶性的蛋白，方便后期的纯化，那推荐低温加低IPTG长时间诱导。温度越高，越容易生成包涵体，IPTG的浓度和产量到不一定成正比，太高反而会抑制，需要摸索出最佳的浓度。
    培养液的体积楼上的已经说了。
    纠正一下楼上的一个错误，煮沸一般是不会让包涵体降解的，包涵体很稳定，你不加尿素，光煮沸变性都不一定彻底

  • PINK (2014-7-02 10:45:18)

    我已经是40度诱导的了，增加IPTG的浓度可以吗？？我用的是18×15的管子，培养基3mL，低温的诱导我做过了，没有区别。只有在40度的时候能诱导出来。那我试试增加IPTG的浓度，可是为什么 把刚摇出来的菌变性跑胶就能看见条带，变性后的样品再放一个晚上，第二天跑就不见了呢？？上样前我有离心，15000r/min，10min.这样有问题吗？？我做了几次都是这样，搞得每次都要重新转化，摇菌。郁闷死了。

  • DONT (2014-7-02 10:45:45)

    表达量太少了！建议楼主更换载体。

  • u234 (2014-7-02 10:46:18)

    从你的电泳图上看，空质粒对照组与诱导组并没有区别，你确信目标蛋白表达了吗？影响蛋白表达量因素是很多的，除了构建合适的表达体系，细菌的培养方法也很重要。新转化的菌表达量确实会比长期存菌的表达量要高，有相关文献报道的．你用的表达载体是什么，是T7启动子的吗？T7启动子表达系统往往会有较严重的渗漏表达，你可以在培养基中加百分之一的葡萄糖或用其他培养基(比如TB培养基），在培养基中加入一定量的利福平也可增加表达量。另外，还有楼上提到的通气量，摇床速度，诱导时间浓度等等，都可以优化的

  • wmp1234 (2014-7-02 10:46:47)


    加葡萄糖是可以在表达前增加菌的浓度，2YT这样的培养基应该说营养是充分的，高营养，高密度，高IPTG（太高会抑制表达），高温这一系列措施都会导致菌体产生包涵体的方向发展。
    估计楼主确实可以换换载体

  • u234 (2014-7-02 10:47:11)

    如果有渗漏表达的话，不要用2YT!不是营养充不充分的问题，是会导致渗漏表达，影响质粒的稳定，进而影响目标蛋白表达量。加葡萄糖就是让为了抑制细菌的自主表达，提高质粒的稳定性。我刚刚做过这方面的实验，用TB培养基加葡萄糖并在诱导一定时间后加利福平能显著提高蛋白表达量。利福平的作用是抑制大肠杆菌本身蛋白的表达

  • orangecake (2014-7-02 10:47:38)

    我的材料有表达啊，在箭头指的那个位置。我用的表达载体是pET-29a，表达菌用BL21.
    关于40度诱导是看一篇文献的它用40度能诱导出来，另外资料上不是说原核表达一般温度范围在16－40度吗？我试过其它温度诱导都不行。只有40度能表达，因此用40度来诱导。

  • gogo (2014-7-02 10:48:10)


    BL21可不行啊

  • orangecake (2014-7-02 10:48:55)

    用BL21为什么不行??要换的话，换哪种表达宿主比较好一些？？

  • 987789 (2014-7-02 10:49:14)


    好像应该用Bl21（DE3）吧。我的蛋白也是变性后冷冻一晚上，在上样前再煮一次用的，连GST好像都表达不出来，是不是哪有什么问题啊？请大家帮帮忙：）
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