【求助】大家帮我看看这张2-DE为什么跑成这样啊？

最新回复

• jkobn (2014-7-02 11:12:38)

  
  1.胶面不干净，有可能是核酸的混入导致的，解决时用核酸酶处理，dxy上有相关的资料；
  2.cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/743512_0.html')，看一看有用处．
  3.电压上不去最有可能的就是盐含量的问题，你是怎么那么确定你的样品里没有盐分呢？怎么除盐：cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/1737922_0.html')
  另外问一下你的胶条是多少宽度的？

• yonger (2014-7-02 11:24:38)

  
  1、应该不是核酸原因，样品中存在核酸会是在凝胶顶部方向产生背景污渍！你的胶面不干净可能银染水质和电泳缓冲液有关！。
  2、垂直拖尾有几种原因可以参考：平衡不充分、第二向缓冲溶液配的不正确，在SDS电泳缓冲液中SDS不够！
  3、除盐的方法有很多，可以考虑TCA丙酮沉淀!样品中脂类多，应考虑样品的制备方法！
  4、看您的蛋白Marker不错，你是如何加样的？请教
  5、除了样品制备方法，聚焦方法也要考虑。看你的凝胶主要是聚焦不好：
  我们试验室的两种聚焦程序可以供您参考对照：为水化聚焦同时进行
  方法一(40V,14hrs/200v,1hrs/500v,1hrs/1000v,1hrs/8000v,0.5hrs/8000v,60000v.hrs；总用时间约为25小时)
  方法二(30V,12hrs/100v,0.5hrs/200v,0.5hrs/500v,0.5hrs/1000v,0.5hrs/2000v,1hrs、4000v,2hrs/6000,2hrs/8000,8hrs/总约87000v.hrs；总用时间26小时左右)
  6、祝你成功！

• qianqin1977 (2014-7-02 11:25:52)

  
  1.我在实验的整个过程中所用的试剂都是用超纯水配的,而且电泳缓冲液也是新配的.胶是用我们实验室的普通扫描仪扫出来的,效果不怎么好,下面有彩色的横条纹.至于胶的背景不干净是不是和我的银染方法有关呢?显色的时候胶的背景就脱不掉.
  2.在整个实验过程中,我只用了生理盐水冲洗样品的血液等,而且在保存前都用滤纸吸干了上面的水分,其它的蛋白制备过程中都没有用到盐类，而且蛋白提取过程中还经过了沉淀，就算是有盐的残留,它的影响会有这么大么?另外我十分怀疑是不是脂类对等电聚焦的影响啊，是的话怎么去除啊，请指教.
  2.to gyhit：胶条是18cm的。
  3 对于您说的应考虑样品的制备方法我深有感触，我也一直都想找到一个好的去脂的方法，也试过用TCA/丙酮沉淀，但是样品跑小板SDS-PAGE的时候发现低分子量的蛋白几乎没有！从我这张2-DE图上也可以看到，不知道小分子量的蛋白都跑哪儿去了，这让我十分的困扰，我一开始是怀疑蛋白裂解液的问题，但是换过几种裂解液效果也都不明显，得到的结果也都差不多。我在database上看别人跑的点特别多，可是为什么我跑不出来呢？请指教！
  * Marker上样的方法：先将Marker点在电极垫片上，再点上融化好的加入了溴酚兰的琼脂糖，置于胶面的顶端，再将胶条置于胶面上，从一端加入琼脂糖，再从另一侧补加，待琼脂糖凝聚后再准备电泳。
  * 我们实验室用的等电聚焦只能设伏时和聚焦时间，设不了您说的程序，仪器比较...hehe,不过还是感谢您的指点。
  hehe,问题比较多，请大家多多指教，谢谢大家！

• qhyu (2014-7-02 11:27:16)

  
  我原来做过两栖动物肝脏组织的蛋白质组学研究，里面也有很多脂肪，对聚焦的影响也特别大，用沉淀的方法对于蛋白的损失较大，而且除脂的效果也不是很好。我当时使用 的方法是：把样品用15000/MIN，4摄氏度离心1H，在100UL的枪头前面再套一个10UL 的枪头，小心地避开脂层，吸上来之后弃去10UL 的枪头，实验感觉这个方法除脂效果还不错。你 可以试一试，有什么问题再联系。

• hold住 (2014-7-02 14:48:35)

  
  我也在摸索2d条件，有个帖子挺好，推荐给你
  cuturl('http://www.ebiotrade.com/newsf/2005-12/20051213112138.htm')

• bring (2014-7-02 14:49:09)

  胶面还算干净，只是好像银染显色时间过度了！我认为是样品中的脂肪没有完全除尽，看是否可以参照标准样品制备方法，可以先用丙酮提取脂质！

• duoduo (2014-7-02 14:49:31)

  
  我们用这个办法除脂，效果不错：15000g离心一小时，接着6000g离心45分钟，能明显看到上面的脂层，避开它吸取下层液体，每吸一次换一个枪头！试试怎么样！

• duoduo (2014-7-02 14:49:53)

  
  不好意思写错了，是15，0000g和6,0000g

• qianqin1977 (2014-7-02 14:50:14)

  0000g和6,0000g是不是已经属于超速离心了啊？我们实验室没有超速离心机，离心机的最高转数只能达到15,000rpm/min。用15,000rpm/min离时间长点效果会好么？

• flower-201 (2014-7-02 14:50:35)

  沉降速度和相对离心力（RCF）成正比，故当离心力小的时候，即需要增加离心时间，如原来40,000g 1h的效果与20,000g 2h是一样的！