【求助】WB中一抗用His-tag antibody 为何可以检测到GST...

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• remenb (2014-7-02 17:37:15)

  你的GST蛋白里有有组胺酸么？26KD那么大的融合头，你全序列都查过？确认蛋白上没有组胺酸的？
  然后你的共纯化具体步骤是怎么样的？是不是和纯化也有些关系？

• xingyi08 (2014-7-02 17:37:37)

  谢谢楼上高人！是的，查了239个aa。 GST里是有组氨酸的，但是都是分散的，抗体说明上指出该抗体识别五个连续的组氨酸，不管在C端，N端还是中间出现的连续五个His。
  我的共纯化过程是GST融合蛋白先与beads结合，室温一小时，pbs洗珠子后加入His融合蛋白再结合，4度过夜。后用binding buffer洗珠子五次。最后珠子加SDS loading buffer 煮几分钟，取上清做WB。

• remenb (2014-7-02 17:37:57)

  
  然后你做对照的GST有HIS信号的样品是怎么得到？会不会有his的污染？
  抗体上说只有5个连续的his才能结合？恐怕特异性没有那么好吧？
  万一<5 的组胺酸也能结合，那你的实验结果就很正常了。

• xingyi08 (2014-7-02 17:38:19)

  GST是pGEX-4T-1 载体转化BL21大肠杆菌，诱导表达后，用Glutathione sepharose 4B纯化的。没有接触过his。
  那么就是说his tag antibody识别的特异性比较差，如果只有一个his也能识别到，那么做这样的WB检测就没有什么意义了是吧？

• remenb (2014-7-02 17:38:38)

  有这个可能的，如果是5个组胺酸的线形表位，感觉特异性不会太好。
  你最好再重复一下实验，再看看其他人有什么建议。
  如果真不行，觉得还是换实验思路吧，好象你这样的做法不多见

• xingyi08 (2014-7-02 17:39:10)

  
  好的，多谢了！其实我也是不得以的，本来准备制备特异性抗体的，但是在his融合蛋白表达时出了问题，耽误四个月时间，快毕业了，来不及再打兔子制备抗体，只好取其下策用融合的his tag的抗体检测。现在觉得好像毕业无望了！！