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【求助】WB系列问题之二：关于SDS-PAGE电泳
【求助】WB系列问题之二：关于SDS-PAGE电泳
各位老师，最近本人做WB检测蛋白的表达变化，碰到不少问题，由于学校放假，师兄师姐都不在实验室了，所以特在此向各位老师请教，希望大家能帮我分析一下出现问题的原因，看看有什么可以改进的地方。谢谢！
其次是电泳时的问题：
关于配胶：
我需要检测的蛋白大小为38kd，采用了12％的分离胶，配胶时各个试剂的用量参考《分子克隆》，只是把TMEMD和过硫酸胺的用量加大了，一位师兄说这样可以加快胶凝固的速度，对后续的实验也没有什么影响。分离胶灌好后上面加双蒸水，37度半小时胶就凝固了，倒掉双蒸水，用滤纸吸干后灌浓缩胶（同样加大了TMEMD和过硫酸胺的用量）。
我看到有人在灌制分离胶的时候是室温过夜的，我想问一下像我目前的操作，有没有什么问题？对电泳的影响大不大？
关于电压：
我们实验室一般是用的恒压电泳，先用80v，待指示剂被压成一条细线的时候改成120v。我在第一次电泳的时候，是用的80v跑完了整块胶，没有改变电压，指示剂在进入分离胶后始终保持很细的条带。但我第二次电泳时，在指示剂被压成细线后换用了120v的电压，结果后来指示剂就弥散成了一个很宽的条带，直至电泳结束。这个现象一直让我感到很奇怪，不清楚原因。不知道有没有哪位老师碰到过？在电泳过程中还需要注意些什么问题呢？谢谢！
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最新回复
wmp1234 (2014-7-03 18:25:54)
没问题.
我经常这么干的.
指示剂只是指示跑完没有,与里面蛋白条带不相关,
(经常是指示剂难看,但蛋白依然PP).
个人经验.
jkobn (2014-7-03 18:26:11)
没有问题的.
溴芬蓝比较容易扩散的.所以看起来是很宽但是实际上蛋白还是压成一条线的.
不用说一直用120跑了,就是一直用180跑都照样可以看出结果.
要想追求漂亮的电泳图其实和上样很有关系,样品一定要煮好后离心几分钟,上样量也少一点好,这样分辨率比较高.
轰轰 (2014-7-03 18:26:33)
溴芬蓝的线是窄是粗与电泳电压没有关系，一般在浓缩时，由于浓缩胶的孔径较大，采用低压可以让样品很好的浓缩到一起，便于在分离胶中电泳时所有蛋白分子处于同一起跑线上。在分离胶中就可以加大电泳加快电泳速度。根据我的经验，溴芬蓝的带变宽或出现拖带现象，应该是你的电泳缓冲液使用次数过多，时间过长引起的，建议重配，使用时电泳的内外槽液分开保存，可增加使用次数。
mod=8048 (2014-7-03 18:26:52)
谢谢楼上各位的回复！我使用的缓冲液的确不是新配的。另外，我们实验室通常的做法是电泳结束后，把内外槽液混合在一起，下次电泳时作为外槽液使用，而内槽液基本上是不重复使用的。我现在对缓冲液的处理也是采用的这种方法，不知道这样的操作有什么问题没有？谢谢！
轰轰 (2014-7-03 18:27:18)
应该就是这个原因，你可以按照我说的做一下看看。
ero11 (2014-7-03 18:27:40)
花茶实验室的做法和我实验室好像
2541 (2014-7-03 18:27:58)
3648755 (2014-7-03 18:28:32)
ffaa (2014-7-03 18:28:55)
ROSE李 (2014-7-03 18:29:13)
都一样啊！我也是那样干的啊，缓冲液回收后用在外槽，我跑胶的电压还是用200v恒压的。没有什么问题啊
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