【求助】免疫沉淀，请教高手相助

最新回复

• zhenxin (2014-7-04 15:41:32)

  
  怎么没有高手指点呀 这个问题是太简单还是太难呀，小妹期待大家的回复呀 thanks

• daod (2014-7-04 15:46:36)

  
  If you use monoclone Ab to pull down the complex, and still use mAb for blotting, definitely there will be another two bands---heavy chain and light chain.
  If polyAb to pull down and mAb blot , or in verse, would be another story.

• 松子儿 (2014-7-04 16:46:36)

  
  why?could you tell me ?/thanks! and the second question?to date,the second question has no answer.could you tell me /

• 松子儿 (2014-7-04 16:46:53)

  
  还有个问题是： 做免疫亲和纯化的时候，有一个 抗体－蛋白A微珠-层析柱制备，里面（抗体实验技术指南）说到了为了检测微珠样品与抗体结合前后的结合效率，将样品分别取出1ul和9ul进行SDS-PAGE，用考染。结合前样品呈现重链区带（分子质量为55KDA）而结合后样品则无，表明交连成功。如何理解这段话呢？ 怎么没有人能够回答我这个问题？难道真的这么难吗？

• u234 (2014-7-04 16:47:12)

  不知道你跑的是变性胶还是非变性胶？如果是非变性胶有可能是Ag-Ab复合物解离
  两条带位置分别在什么位置？你的Ag是多大分子量的蛋白？
  如果不是Ag-Ab复合物解离，那即使重链轻链解离，那也该还是和Ag结合在一起的。应该不会呈现2条带，可能还是复合物解聚。
  对于第2个问题是这样的，IP先要把抗体的Fc端结合在proteinA上，然后再用抗体的Fab端去亲和抗原，形成复合物。
  关键是首先要确保有足够的抗体结合在protienA上，所以要检测结合的抗体到底有多少。
  所以要用没有结合抗体的protein A微珠样品和上了抗体样品后的protein A微珠进行对比的电泳。
  如果成功的结合了抗体，电泳后，应该有抗体的条带
  反之胶上面应该没条带的
  微珠在跑电泳时是跑不下去的。

• 松子儿 (2014-7-04 16:47:38)

  首先感谢你的帮助。因为我后面要做蛋白的免疫化学。所以你的解释对我很重要。不过我还是不太放心。所以敢问一下你确信你的解释是对的吗？我总感觉是不是还有其他原因什么的，呵呵。敬请指导！不胜感激！

• is2011 (2014-7-04 16:48:00)

  科研没有绝对的事情。实验过程中会出现各种各样意想不到的原因。
  所以才需要你来研究这个学问，你都还没提供我上面那个帖子里的问题，所以也不敢乱下结论
  呵呵我只是帮你分析了一下我认为的原因，至于对与错，就要看你自己的见解了。
  补充一点，
  如果是变性胶的话，也许会出现3条带，一是抗原蛋白，二是重链，三是轻链。

• 松子儿 (2014-7-04 16:48:55)

  
  哦，对了，不好意思.我没有跑电泳。我主要是在看抗体实验技术指南这本书时候，有写地方没有理解。关于免疫沉淀后有两个条带，有人说是重链和轻链解离所致。你说的非变性胶会致Ag-Ab复合物解离，为什么呢？
  “如果不是Ag-Ab复合物解离，那即使重链轻链解离，那也该还是和Ag结合在一起的。应该不会呈现2条带”。我感觉如果是重链和轻链解离，即使和抗原结合在一起，也有可能是两条带压，为什么你说不会呈现两条带。你的意思是不是说结合位点是需要重链和轻链共同构成，所以即使解离了，也不会出现两条带？
  再次感谢你不停的支持我的疑问。

• u234 (2014-7-04 16:51:53)

  
  如果复合物不是很牢固，比如说抗体活性不高等等原因
  在SDS存在的情况下，有解离的可能。
  如果是变性胶，那里面的还原剂确实会把重轻链之间的S-S键给打开，不过也要看还原剂的浓度的。
  抗原抗体结合是重轻链共同完成的，不过有时如果已经牢固结合在抗原上后，即使重轻链的2硫键打开了，重轻链还是会会黏附在抗原上的
  实验之前所有的理论准备都是要靠后面的实际动手来验证的，所以多做做实验，做做对比，在实验中才能发现很多问题和科学道理。
  万一什么时候，让你发现了和经典理论不一样的事情，那中国第一个本土的诺贝尔奖就是你的啦！哈哈