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【求助】包含体洗涤
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包含体洗涤：洗涤液A：20mM Tris-Cl(PH8.0) 5mM EDTA 0.5% TritonX-100
洗涤液B：20mM Tris-Cl(PH8.0) 5mM EDTA 1M 尿素
洗涤液C：20mM Tris-Cl(PH8.0) 5mM EDTA
按1：10（包含体： 洗涤液），分别用 洗涤液A、B、C，超声波洗涤（600）3分钟或搅拌洗涤30分钟后，12000转/分钟，离心15分钟，将上清夜做电泳，结果上清夜里有目标蛋白，即洗涤液将部分包含体溶解了。一般情况下，TritonX-100和低浓度的尿素不会溶解包含体，请问是何原因？包含体应怎样有效地洗涤，且损失少？同样条件下，将离心时间延长为30分钟，结果一样。
请大家指教！
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最新回复
huifeng0516 (2014-7-04 17:32:49)
既然跑PAGE胶都能看的见条带，那么就说明上清中目的蛋白的浓度不低。曲钠通是去垢剂，确实不能溶解包涵体，低浓度的尿素不是不能，只是溶解的量非常的小。我洗涤包涵体的时候，曲钠通用的是4％的，低浓度尿素用的是2M的，虽然上清中也有目的蛋白但浓度很低。不影响下一步实验要求。
楼主是否鉴定过PAGE胶上与目的蛋白同样分子量大小的东西是否真正是目的蛋白，是不是与目的蛋白具有同样分子量的杂蛋白呢？按理来说这种可能性大。
另外，如果楼主下一步实验是要纯化的话，我认为洗涤液A和B足够了，没有必要再用C来洗，直接用溶解液来溶就可以了，因为蛋白经过越少的处理越具有天然活性。
还有一点小建议，离心速度偏低，可以使用15000/15min。
bamboo16 (2014-7-04 17:33:33)
你要自己做试验，作几个梯度浓度的尿素，多长时间，小量的做一下，离心的上清和沉淀都跑下电泳，选择合适的浓度和时间，各个人都有不同的
remenb (2014-7-04 17:34:03)
我发现包含体有黑色的东西，是不是炭化了，包含体洗涤是部分溶解？另外请教：我采用的超声波功率900W，工作时间3S，间隔时间2S，破碎菌体溶液100毫升（10%的菌体量），冰浴打20分钟，请问这样打菌体是否合适，会炭化。如果按我的菌体破碎量，应该怎样打超声波合适（如功率，时间）。
huifeng0516 (2014-7-04 17:34:38)
QUOTE:
首先，超声后出现黑色的东西是正常的，我个人理解是由于收集菌体时不干净或是由于超声过烈导致菌体出现炭化现象。但是不影响后续实验，因为超声后离心一个目的是收集包涵体，另外一个目的就是去除杂质了。我也试过超声2s/2s，但是效果不是很好的。所以我现在改用超声10s/10s，超声120次，超声之前将收集的湿菌体用PBS重悬时用的量是每克湿菌体加8ml的PBS。然后在重悬后将样品反复冻融5、6次（60min/10min），冻融的目的是为了更好的裂解菌体。
既然你的超声方法不是很理想，那么建议楼主用我的超声方法试一下看看效果。
其实有的菌体裂起来是不难的，就像我的（BL21)，但是有的就比较难，也许楼主的菌体比较顽固吧。如果超声还是不能完全裂解的话，楼主可以使用一下溶菌酶。由于大肠杆菌BL21系自带溶菌酶，所以我是没用溶菌酶的。
祝好。
remenb (2014-7-04 17:34:59)
huifeng0516 (2014-7-04 17:36:04)
QUOTE:
不明白战友这个超声的量指的是什么，是超声的样品量吗？那我就是按我上面那个帖子做的（每克湿菌体加8ml的PBS）。我每次摇菌都摇50ml，大概能收集到1g左右的湿菌体。看你的重组菌表达目的蛋白的量高不高来确定你到底摇多少菌才够你下一步实验用。超声的功率和楼主一样的，我认为超声也是像我上面提到的一样，根据不同的菌系来确定超声的强度、时间、次数等等。实验就是这样嘛，需要自己去摸索。
祝好。
remenb (2014-7-04 17:36:23)
huifeng0516 (2014-7-04 17:44:46)
所谓复性也就是加入变性剂溶解，使之成为可溶性伸展态，再除去变性剂使表达产物折叠恢复天然构象及活性。但是问题在于，在体外折叠时，蛋白质分子间由于存在大量错误折叠和聚合，复性效率往往很低。究其其原因，蛋白质的立体结构虽然由其氨基酸顺序决定，然而伸展肽链折叠为天然活性结构的过程还受到周围环境的影响。所以，复性的效率我不敢说，呵呵。
但是我觉得透析的方法应该不适合大规模的工业化生产，我觉得您应该选择其他的复性方法，复性的方法有很多种的 ，如稀释等等。由于另外的复性方法我没怎么看过文献，也没有做过，所以不知道怎么样，但是无论用什么方法，在使用前都应该看看有关的文献了解一下。
remenb (2014-7-04 17:45:21)
1.裂解菌体
缓冲液：20mM Tris-Cl(PH8.0) 5mM EDTA ，湿菌体：缓冲液=1：10，用900W超声波冰浴打20分钟，间隔时间2S，工作时间3S。
2.包含体洗涤
洗涤液A：20mM Tris-Cl(PH8.0) 1mM EDTA 0.1% TritonX-100 50mMNacl 2M尿素用900W超声波冰浴打15分钟，间隔时间2S，工作时间3S。象这样共洗涤3次，
洗涤液B：20mM Tris-Cl(PH8.0)用900W超声波冰浴打15分钟，间隔时间2S，工作时间3S。象这样洗涤1次，
3.以上离心12000转/分，离心10分钟。
请问为何包含体得到如此少？
huifeng0516 (2014-7-04 17:46:54)
QUOTE:
愚见：可能原因：
1、大肠杆菌存放时间过长，由于大肠杆菌本身自带溶菌酶，所以可能是你不用超声菌体已经大部分裂解了，然后你超声可能破坏了包涵体。
2、超声时间过短，部分菌体未裂解完全。
3、何必每次洗涤过程中都用超声呢。
以上只是几种可能导致你情况的原因，建议试用新转化的菌体，另外按经典方法再试试。
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