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【求助】关于丙酮沉淀蛋白质的问题

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2014-7-04 18:15    作者: @STAR@    来源: 分析测试百科网

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【求助】关于丙酮沉淀蛋白质的问题

向大家请教，我用80%丙酮＋0.12%DTT（预冷）沉淀血清蛋白质，沉淀时间是4°C过夜，然后12000rpm离心30min。倒去上清以后室温放置10分钟左右挥发残留丙酮，最后用裂解液重悬（7M UREA,2M THIOUREA,4%CHAPS,2mM TBP,1mM PMSF,0.2%biolytes），可是沉淀极难溶解，到最后成了一块类似QQ糖的半透明不溶物。我不死心，让它溶解过夜，第二天还是这样，只好离心一下，把上清吸过来。哪知道2天后这个上清也变成了胶冻状了，各位有什么办法解决这个问题吗？
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最新回复

  • nut6694 (2014-7-04 18:15:27)

    你也遇到这个问题了，蛋白浓度大了，血液应该做了稀释再处理。
    祝您实验顺利哦！

  • @STAR@ (2014-7-04 18:15:44)


    谢谢！再问问，已经成了胶冻状的样品还有什么办法恢复吗？样品比较珍贵

  • nut6694 (2014-7-04 18:16:04)


    实在不好意思，目前还没有找到合适的方法Sad

  • qqq111 (2014-7-04 18:16:28)


    丙酮沉淀时间越长就会越难溶!
    如果没有特殊要求的话, 在-20°C沉淀40~60min就行了.

  • bring (2014-7-04 18:16:47)

    丙酮沉淀的蛋白确实非常难溶解
    建议换用TCA-丙酮沉淀， 溶解的过程中可考虑适当加些碱液

  • moonlight45 (2014-7-04 18:17:10)


    丙酮沉淀蛋白后建议使用低温真空干燥完全祛除残留丙酮,楼主的方法我认为是不能完全祛除丙酮的,残留的丙酮回对豁免的实验产生影响.完全祛除丙酮的蛋白是类似奶粉的干粉状物质.楼主的裂解液没有问题,一般6-10mg蛋白干粉可以添加1ml裂解液,4度过夜.蛋白太多会影响溶解效果.过夜后应该大部分蛋白都溶解,仍然会残留部分类似果冻状半透明的没完全溶解的蛋白,可以采用冰浴超声助溶,效果非常好,超声完毕17000g.离心10min,取上请即可.
    楼主遇到的问题会不会是残留丙酮造成的呢?

  • hold住 (2014-7-04 18:17:31)


    Post solubilisation TCA/acetone extraction may be required (Jefferies et al, 2000) to remove problematic components and this can be combined with SDS solubilisation. If you do use this method be aware that the subsequent protein pellet can be very difficult to resolubilise. We find that the addition of a small volume of 0.1M NaOH can be really useful in overcoming this problem. Start with a few microlitres and increase the volume until the pellet dissolves, agitating the sample as you go, but don't add to much.

  • hold住 (2014-7-04 18:17:53)


    Sonication may also help to increase the solubility of the sample, in this case we use a waterbath sonicator
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