【求助】GST融合蛋白纯化不出来

字体: 小中大 | 打印发表于: 2014-7-04 18:18 作者: qiangren789 来源: 分析测试百科网

融合蛋白表达的不是很好,经sarkosyl处理以后是可溶的,用上清作纯化,做了两次什么都没洗脱出来.填料应该是没问题的,因为用来做空载体GST的纯化,洗脱出大量的GST.最近又用融合蛋白做了一次纯化，洗脱后竟然发现在26kD附近出现了微弱的条带，请问是GST掉下来的结果吗？我该怎么办？心急如火，请大家帮帮我！

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【求助】GST融合蛋白纯化不出来

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zwsyrt (2014-7-04 18:19:24)

QUOTE:
原帖由 qiangren789 于 2014-7-4 18:18 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

融合蛋白表达的不是很好,经sarkosyl处理以后是可溶的,用上清作纯化,做了两次什么都没洗脱出来.填料应该是没问题的,因为用来做空载体GST的纯化,洗脱出大量的GST.最近又用融合蛋白做了一次纯化，洗脱后竟然发现在26kD附 ...
最常见的原因是破碎导致GST部分失活,或者是样品处理时间长导致失活,只要GST部分没有活性,神仙也做不出,所以破碎要温和,破碎完马上纯化,此外可以在样品以及平衡缓冲液中加5mMDTT这样可以改善吸附效果,如果样品也浓,可以先把样品和填料摇床上
qiangren789 (2014-7-04 18:19:46)

谢谢楼上的.我是用蛋白与Glutathione Sepharose 4 Fast Flow共同作用,摇床上两个小时,没有过柱子.另外我看有的是加PMSF和一些蛋白酶抑制剂,这些是必要的吗
zwsyrt (2014-7-04 18:20:09)

PMSF是需要加的，时间长很必要，也许还是样品处理的问题．
qiangren789 (2014-7-04 18:20:27)

可否具体说一下需要加多少,什么时候加呢,是在超声破碎以后吗?
memory (2014-7-04 18:20:53)

可否具体说一下需要加多少,什么时候加呢,是在超声破碎以后吗?

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加在裂解液里.
纯化是个很难的工作,大家一起多交流!
zwsyrt (2014-7-04 18:21:18)

２－５mM
xue258 (2014-7-04 18:21:38)

兄弟，我也有同样情况，还没有解决，请问你的空载体gst不用sarcosyl可以溶解在上清吗？
qhyu (2014-7-04 18:22:01)

我最近一直在做GST融合蛋白的纯化，超声处理之后，可溶的，不可溶的蛋白都遇到过，PMSF等蛋白酶抑制剂是必需的，应该在超声之前加入。比如你超声处理是液体体积是8ml,PMSF的stock是0.1M，则需加入80微升PMSF，终浓度是1M。
toy (2014-7-04 18:22:25)

如果你不准备切掉GST，可以加蛋白酶抑制剂，如果要切，千万不要加，切完再加。另外我纯化的GST fusion protein除了我想要的大小，稍低分子量还有两条弱的带，anti-GST WB阳性，应该是掉下来了，一些文献中也看到过GST fusion protein有这些ghost带，如果作功能不影响的
小野花 (2014-7-04 18:22:44)

样品裂解后，可以加入一两倍体积的结合缓冲液，再结合；或者用Triton X-100代替sarkosyl