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【求助】western blot转膜的困惑！

字体: 小中大 | 打印发表于: 2014-7-05 15:58 作者: feima+ 来源: 分析测试百科网

昨天第一次作WB，转膜（15v，30min，我转的蛋白一个是40kDa，一个是92kDa）后，丽春红染色发现仅仅在膜的最上端有几条蛋白条带，而且6条泳道的条带基本在同一位置，位于分离胶的最顶端。Marker也只看到最上面的2条带。转膜后的胶考染后，看到的情况跟膜上的基本一样，很奇怪！
考染的胶显示的蛋白条带密集，但长度不是特别长。我放弃了继续实验。：（
今天又跑胶，考染的胶比昨天要好，marker也清楚全部显现，但转膜后丽春红染色Marker只见2条带，其中一条很清晰，蛋白样品只非常隐约看见最上端有，这次我继续进行实验，加了一抗，4度孵育。转膜后的胶考染脱色正在进行中........
请大家帮我分析一下吧，为什么转膜会出现这样的情况呢？我的积层胶用0.5M Tris.Hcl，不知道是否会有影响？

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【求助】western blot转膜的困惑！

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feima+ (2014-7-05 15:58:58)

转膜后的胶考染脱色后，上面竟然有蛋白条带，Marker最上端的条带也清楚显现，但小分子量蛋白的条带看不到，膜上也看不到。难道要继续增加电压or电转时间，昨天已经加到15v 60min了，我担心再加的话，小分子量的蛋白岂不是全要转过头了呢，如何保证蛋白的电转率呢？
zsxan1990 (2014-7-05 15:59:19)

做western最重要的前期准备是要保证首先电泳得跑好，我感觉你的问题是出在第一步蛋白电泳上。
bling (2014-7-05 16:00:05)

综合考虑了一下，你的问题或许和下列因素有关
1.配制胶的各溶液浓度和pH值是否有问题？最明显的问题是，你的浓缩胶用0.5M Tris.Hcl，我不知道你是真的不知还是自做聪明，有些东西别人书本上写的很清楚了，睁大眼睛看看，应该是1M，而且pH值是6.8，对应的分离胶用1.5M Tris.Hcl，pH值是8.8
2.电泳过程中一般先用小伏电压如100V等溴酚兰进入分离胶后可加大到160V以上进行到底－仅做参考
3.不知你的电转装置用的是什么型号的，一般来讲，电转用恒流进行，而且我的经验告诉我80mA进行3h效果就很好
4.既然连续两次都看不到小分子量的Marker，完全有可能是Marker降解，或者转膜效果本来就太差！
5.“转膜后的胶考染脱色后，上面竟然有蛋白条带，”丝毫不足为奇，转膜并非将蛋白全部转移。
看到你的问题，觉得有些非常明显的低级错误，想要说明的是，实验之前请多查阅，不要茫然进行！非常抱歉！
wmp1234 (2014-7-05 16:00:33)

我用的浓缩胶是0.5M, PH6.8,分离胶是1.5M,PH1.5
猜想你用的可能是半干转吧，我也常做小分子量的蛋白，感觉你的电压有些低，你可以把电压调大一些。
另外转膜后的胶考染脱色后，上面也会有蛋白条带的，不会非常完全的。
如果，你想追求更好的效果，可以尝试用湿转。
yjf1026 (2014-7-05 16:00:51)

有道理,建议班竹能定期把遇到的问题总结成资料库,这样就可以节约大量时间且内容丰富
feima+ (2014-7-05 16:01:09)

感谢大家对我的帮助，其实我做第二次WB，虽然转膜不理想，但我还是硬着头皮望下做了，结果发光显色后条带很漂亮，与marker相比，分子量也对，而且没有杂带。
但转膜确实存在问题，我个人也觉得可能是跑胶跑的不好，电转仪是BIO-RAD，算很好的了。所以我今天重新配制试剂，包括1.5M Tris－hcl，核对了pH。
希望这次能转膜效率高点，因为我作定量检测，担心转膜效率会影响结果。
DONT (2014-7-05 16:01:27)

不知道你做的是湿转还是半干转，湿转一般用恒压，半干转一般用恒流。看得出你的大分子蛋白的转移效率不够高，一般来说，电转缓冲液中甲醇含量高时对小分子蛋白转移有利，反之对大分子蛋白有利，所以你不妨可以减少电转缓冲液中的甲醇含量再来看看转移效果。
mimili_901 (2014-7-05 16:01:45)

如果是湿转的话，我一般用恒压转，100V冰浴转
2h。觉得你的电压太低了