【求助】大半年了，快急死了

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• xyw5 (2014-7-07 15:05:15)

  
  SDS-PAGE就是还原电泳啊，其中的样品缓冲液中有2-ME或DTT，样品跑出来全是单体才对；非还原电泳中倒有可能出现单体和多聚体共存的现象。

• mimili_901 (2014-7-07 15:05:35)

  
  有没有确定这个蛋白有几对二硫键？是表达的重组蛋白吗？你跑得样品是全菌还是抽提的上清呢？
  从你的信息来看，感觉头绪有些乱。一般凝胶过滤一个峰，说明只有一个单体活一个二聚体，可以再跑一个还原电泳和非还原电泳，对比来看，确定表达出的到底是单体还是二体。
  非还原电泳结果同时有单体和二体是正常的，因为胞内的二硫键折叠酶系会对蛋白的重新折叠进行加工，另外也和蛋白样品、抽提方法、宿主的表达都直接相关。

• zwsyrt (2014-7-07 15:05:58)

  
  正常，蛋白样品放置一段时间后， 有时候蛋白质中的半胱氨酸残基会相互交联形成二聚体或多聚体，你的蛋白可能就是这种情况，防止这种情况发生的方法是在蛋白质样品中加入低浓度的DTT或巯基乙醇，当然，条件是你的蛋白本身没有二硫键，如果你的蛋白有二硫键，那就无能为力了。

• NBA (2014-7-07 15:06:32)

  
  一点分析：
  1.还原电泳全部为单体，充分说明了你的蛋白发生了聚合。
  2.首先经superdex 75(柱效9000)，单峰，单峰可能是假象，可能纯化这步就没有把聚体与目的真正的分开，建议将您的蛋白做一下SEC-HPLC（柱效与分辨率都能满足），凝胶层析柱要适合你的分子大小.
  3.如纯化没问题，就要看看你的样品浓度和储存条件，浓度太高、保存条件不当都会使样品有一定的聚合。
  4.再有你的缓冲系统是不是适合你的样品，如果是纯化的问题你就要看看你的纯化条件了（包括层析步骤、选用的介质、缓冲系统、层析条件等）
  

• NBA (2014-7-07 15:06:52)

  
  我的几种蛋白都有二硫键，由于纯化控制的好，样品纯度都大于99％，只是有时有点几的聚体。
  

• NBA (2014-7-07 15:07:10)

  
  SDS-PAGE包括还原SDS-PAGE和非还原SDS-PAGE 。

• qqq111 (2014-7-07 15:07:55)

  什么是SEC-HPLC?
  能详细一点吗？
  谢谢！^_^

• orangecake (2014-7-07 15:08:20)

  
  SEC就是分子排阻色谱，也就是你用superdex 75这样的分子筛
  HPLC，是高效液相色谱
  不过个人觉得，你的蛋白要是大与50KD的话，就不适宜用HPLC了

• fsdd817 (2014-7-07 15:08:58)

  一点分析：
  2.首先经superdex 75(柱效9000)，单峰，单峰可能是假象，可能纯化这步就没有把聚体与目的真正的分开，建议将您的蛋白做一下SEC-HPLC（柱效与分辨率都能满足），凝胶层析柱要适合你的分子大小.
  
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  您好，向您请教一下，SEC单峰是假象是什么原因呢？能否具体解释一下。以前接触过一个蛋白，电泳银然一条带，HPLC一单峰，但毛细管凝胶电泳却是双头峰，本来怀疑是蛋白的不同构象，但又无法确认。最后通过纯化工艺达到了检测要求，但还是没有弄清当时的问题所在，您可否指点一些。

• NBA (2014-7-07 15:20:14)

  
  1.凝胶过滤并不依赖蛋白质分子与柱材料的结合来分离蛋白。这个特点的一个好处是，所有的蛋白样品最后都能被洗脱下来，柱子重复用也不会有什么问题。
  2.缺陷：低分辨率。分辨率包括两个因素，一个是两个蛋白峰的距离，另一个是，蛋白峰的宽度。由于蛋白在凝胶柱里面并不与柱材料相互结合，所以很容易扩散，扩散的结果就是蛋白峰非常宽。这个宽度非常要命，很多时候即使用了很好的柱子，蛋白顶峰也大致能分开, 但是由于蛋白峰太宽，重叠在一起，这样就很难分干净。
  3.另外，两个不同大小蛋白的洗脱体积的差别与分子量差别的对数呈线性关系，所以，如果分子量相近（比如只差两三倍）的话，洗脱位置也会相近，凝胶过滤，是很难把两个蛋白完全分开的。
  4.SEC-HPLC由于填料比较细，柱内径较小，因此分辨率还能满足分析。
  5.至于毛细管电泳它更具有高的分辨率，如果您的蛋白是糖蛋白，由于糖基化稍有不同，HPLC和电泳能满足分辨率将微小差别大小的分子进行分离。如果怀疑是构象的变化，RP-HPLC能够进行同分异构体的分离。（仅是个人见解，请多包涵）
  6.至于楼上一位站友说大于50kd，不适宜HPLC，我不太同意因为我的蛋白有一为200万的抗原，还能很好的分离，保持较高的柱效，您需要订购满足分辨率的色谱柱，我可以给您提供相关信息。

• fei1226com (2014-7-07 15:21:01)

  
  楼上的说大于50kda是指HP-RPC吧？
  楼上战友用于分离2000 kDa的蛋白的柱子是哪家的阿？什么型号呢？要是SEC的就一点儿不奇怪了，要是RPC，愿闻其详

• NBA (2014-7-07 15:21:23)

  
  呵呵，版主您分析的很对，2000kd的大分子反相柱肯定是不行的，我用的是***一家公司的分子筛凝胶柱，公司的名称是TOSOH，柱子型号：TSK-G5000PW。一般反相柱柱由于介质结构的原因，不能分析太大分子量的大分子。