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【求助】PCR-RFLP酶切求助
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各位好：
小的最近做的是pcr-RFLP来多态性分析，能够很好P出目的条带，就直接用PCR产物用来酶切。但是，酶切之后，基因型的判断遇到了大难题。各位秀友，能不能给我点意见，痛苦，实验停止不前了。
目的片段206bp，片段太小，用的是PAGE跑核酸。完全切开后，137bp+69bp。成像后，酶切后呈现3条带的情况有两种，一种是206bp片段最亮，其余次之，这个应该能判断为杂合子。另一种情况，137bp最亮，206bp很淡，但是肉眼能够看到，严重影响到基因型的判断。朋友建议说如果真的是杂合子，应该206bp最亮，其余次之，很有可能是酶切不完全，于是我做了3个酶切体系，1.PCR产物10ul，酶1ul（10U），2.PCR产物15ul，酶1ul，3.PCR产物15ul，酶2ul（酶已经非常足量），而且酶切整整16h，PAGE电泳，全部上样后，3种酶切体系结果一样，137bp最亮，上面有淡淡的206bp片段。。。。
而且最大片段最亮，可以判断为杂合子，4泳道只有一条带，可以判断为纯合子，其余条带虽然看着像3条带，像杂合子，但是最大的片段不是最亮，而是137bp也就是中间的条带最亮，更改酶切条件后，更加酶的量至2ul，延长酶切时间至16h，出来的结果一样，也是不正常的3条带。按理说，酶量很大了，不存在切不开的可能了。
各位帮我看看，拜托了，实验停止了，我已经酶切了很久了，都是出来类似结果，要是酶有问题，为何有的能很好的切开？拜托了，各位。在此谢谢了。
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最新回复
pou (2014-8-27 17:38:19)
PCR扩增的时候会不会对等位基因中的一个有偏好啊，比如说对其中的一对模板扩增的效率要高于另一对模板（可能由于碱基的突变造成模板形成新的二级结构）？这只是一种瞎猜啊
fei1226com (2014-8-27 17:39:43)
QUOTE:
首先谢谢您的回复哈，哎，心都凉了，都没有人来回复我，我实在是找不到解决办法，实验就这么停着了。。。。这几个酶切体系，除了模板不同，也就是来自不同的病人，其他都是一样的。可是问题是前三个就能很正常的切开，，后面的就出现那种情况。
要是出现您提的那种情况，前三个泳道就解释不了呢。费解中。
谢谢你了哈。
yjf1026 (2014-8-27 17:40:02)
我觉得你可以把206bp的带（后几条泳道）回收了，测个序。还有就是酶切时间过久酶活力会下降（甚至产生新酶活性，不特异），假设后几条带是纯合的并且真没有切干净，这时候你可也在切过几小时后再加一些新酶试试
ns5fan (2014-8-27 17:40:22)
lane 4:纯合子
lane1,2,3,5:杂合子 206亮,说明其中不能被酶切等位基因比例高
lane 6-10:杂合子 137亮,说明其中不能被酶切的等位基因比例低
fei1226com (2014-8-27 17:40:45)
QUOTE:
谢谢您的回复。我看某个论坛，一个前辈也是出现过类似情况，他送去测序后是纯合子。我现在就重新摸条件。【求助】PCR-RFLP酶切求助