【求助】求PCR高手解答

最新回复

• redbutterfly (2014-8-27 17:59:54)

  
  7500bp？这么长啊，是不是pcr条件要摸索一下啊？

• leifengta (2014-8-27 18:00:10)

  
  出现1,2条带很像是模板浓度过大所致。因为你的目标片段比较长，模板量如果太大的话，会造成非目的片段相对含量增加，且PCR过程中dNTP很快消耗完，之后进行的都是无效扩增，会得到弥散状条带。建议减少模板量，增大PCR反应体系。后面的两个，貌似出现了非特异性扩增，建议升高退火温度2-3度。你可以再问下你的师兄师姐。另外，你照相时不知是特异这样放，还是放反了。

• ending (2014-8-27 18:00:39)

  
  我以为1，2条弥散带并非模板量太大所致，因为模板过多而弥散一般均匀分布或通常小于目的条带，而上图中的弥散则偏大！鉴于大片段扩增的特点，稀释模板和较少循环数可以考虑，另外引物的特异性应该得到保障，如果还不理想，可采用降落PCR扩增。

• eric930 (2014-8-27 18:01:36)

  7500bp？这么长啊，是不是pcr条件要摸索一下啊？
  
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  感谢您的回答，7500bp都不算长，我这还有个12.5K，主要是条件摸索了很久，最好的就是这结果了

• eric930 (2014-8-27 18:01:53)

  出现1,2条带很像是模板浓度过大所致。因为你的目标片段比较长，模板量如果太大的话，会造成非目的片段相对 ...
  
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  感谢您的回答，我的模板起始量为30ng，不过体系是20的体系。另外主要的是目的条带不出现，而亮的条带位于胶孔处，感觉堵孔的样子，因为就这个PCR出现了这个现象，不知道什么原因造成

• eric930 (2014-8-27 18:02:18)

  出现1,2条带很像是模板浓度过大所致。因为你的目标片段比较长，模板量如果太大的话，会造成非目的片段相对 ...
  
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  主要是公司实验室的拍照就这习惯，一直就沿用下来了

• eric930 (2014-8-27 18:10:14)

  我以为1，2条弥散带并非模板量太大所致，因为模板过多而弥散一般均匀分布或通常小于目的条带，而上图中的弥 ...
  
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  主要是堵孔的现象，不知道这是如何产生的？

• toy (2014-8-27 18:10:45)

  
  胶放反了吧

• eric930 (2014-8-27 18:11:11)

  QUOTE:

  原帖由 toy 于 2014-8-27 18:10 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  胶放反了吧

  形成习惯了

• yes4 (2014-8-27 18:12:34)

  
  换LA taq酶呗！模板浓度低一些！

• BUK (2014-8-27 18:12:57)

  QUOTE:

  原帖由 yes4 于 2014-8-27 18:12 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  换LA taq酶呗！模板浓度低一些！

  我用的就是宝生物的LA taq

• 小游abc (2014-8-27 18:13:31)

  主要是堵孔的现象，不知道这是如何产生的？
  
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  堵胶孔可以有很多原因，首先排除电泳和胶的问题，DNA 模板不纯或用量太大也会出现，分子水平的解释可能是DNA与蛋白等杂志分子形成络合物共电泳，其电荷/质量比急剧降低，电泳速度降低，胶孔分子阻力增加甚至无法出孔。建议：适度稀释模板（10-100倍），调整体系（参照标准体系），减少Taq酶用量，提高变性温度，增加时间（95或96度，1min）。

• guagua (2014-8-27 18:14:02)

  感谢您的回答，我的模板起始量为30ng，不过体系是20的体系。另外主要的是目的条带不出现，而亮的条带位于 ...
  
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  按照你的叙述模板量没有问题，体系大小也是可以的。长片段扩增，模版的量变化范围不能太大，你的模板量比例是可以的，我看到1号带已经出现目的片段了，你再仔细看下；2号条带没有出现目的片段。建议再试一下降落PCR，前8个循环从65降到58度，保持58度。体系中添加小牛血清蛋白（BSA），配制一个新体系和原体系同时扩一下。不知道你的退火温度是多少，可以在你现有的基础上减少2-3度（提高结合效率），再试一下。做实验有时确实需要多试几次。我也不确定这些改进能否完全解决你的问题。降落PCR和添加BSA我用过，普通扩增感觉很好。降低退火温度根据PCR原理和你的胶图自己推测的温度减少量，参考《分子克隆实验指导》第三版616页和670页，可以到图书馆借阅。希望可以帮到你。

• guagua (2014-8-27 18:18:39)

  我用的就是宝生物的LA taq
  
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  我也做过半年的全基因测序补洞工作，你可以试试不同的模板浓度，还有不同的退火温度，如果不管怎么样都扩不好的话，你就重新设计引物吧！我一般的体系是94度5min；94度30s、62度45s、72度5min，30cycles；72度20min。25ul体系我一般加0.18ul酶。引物对长片段的扩增影响是很大的。祝好运

• guagua (2014-8-27 18:19:00)

  我用的就是宝生物的LA taq
  
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  我也做过半年的全基因测序补洞工作，你可以试试不同的模板浓度，还有不同的退火温度，如果不管怎么样都扩不好的话，你就重新设计引物吧！我一般的体系是94度5min；94度30s、62度45s、72度5min，30cycles；72度20min。25ul体系我一般加0.18ul酶。引物对长片段的扩增影响是很大的。祝好运！

• 9妖9 (2014-8-27 18:19:24)

  
  你最后P出7000多的条带了吗？我最近也是在扩6000bp的片段，出现和你一样的情况弥散条带，你是怎么解决的最后？
  

• #甜# (2014-8-27 18:19:41)

  请问用的PCR酶是哪个公司的？