【求助】PCR退火温度梯度的设定

最新回复

• vvmmoy (2014-8-30 11:23:05)

  退火温度跟引物序列有关，一般来说退火温度=Tm-5，Tm=(C+G)*4+(A+T)*2,但不是绝对的。

• wiwi (2014-8-30 11:23:35)

  一般的PCR仪允许设置跨度12-15度的梯度范围，所以你的梯度范围尽可能设置宽一点，争取一轮梯度就可以确定最佳可用退火温度。
  具体从多少度到多少度，要看你这对引物的Tm值，如果两个引物Tm值不高，可以设置48-60的梯度；否则可以设置58-70度的梯度；如果两个引物的Tm中等，则可以设置53-65的梯度范围，具体情况灵活掌握。
  传统梯度PCR仪中是可以放置12个样品进行梯度的，需要注意的是每个相邻两孔间的温度差异是不等的，尤其是第2、3孔与第1孔接近，第10、11孔与第12孔接近。可以舍弃第2、2、10、11孔，只在第1、4、5、6、7、8、9、12孔中放置共8个样品，孔间温度变化几乎呈真正的梯度状。
  ABI公司新推出的Veriti梯度PCR仪有6个独立控制的block，类似6台PCR仪，每个block上的退火温度可以独立设置，因此梯度设置更可控一些，范围还可以宽一点。

• zzzz (2014-8-30 11:23:52)

  你可以把你的SEQUENCE直接输入primer5.0 ,然后输入你设计的引物序列进行分析,软件会给出一个最优化的pcr反应温度,你可以根据这个温度设定上下各5度,直接进行温度梯度PCR, 但这个温度的间隔是PCR随机设定的,通常不是等温度差,你可以自己再分析一下!哈哈!

• 831226 (2014-8-30 11:24:23)

  那在机器上怎么设定，谢谢