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同工酶检测——电泳法
关键词：有机标准样品 进口标准物质 中检所对照品 美国USP标准品同工酶检测——电泳法
由于同工酶(或亚型)一级结构的不同，导致其在理化性质、催化性质、生物学特性等方面有明显的差异，这些差异为同工酶(或亚型)的分析和鉴定提供了理论基础(表5-6)。临床同工酶(或亚型)的分析大致可分为两步，即首先精确地分离出某酶的各同工酶(或亚型)组分，然后测定酶的总活性和各同工酶(或亚型)组分的活性。
同工酶氨基酸组成不同，等电点不同，电泳迁移率也就不同，据此可用电泳法分离鉴定。常用于分离同工酶的电泳方法有醋酸纤维素薄膜电泳(cAE)、琼脂糖凝胶电泳(AGE)、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)等。以LD同工酶为例，H亚基含酸性氨基酸比M亚基多，在pH 8．6的碱性缓冲溶液中带负电荷较多，电泳速度比M亚基快，电泳结束时由正极向负极依次有 共5条同工酶条带。电泳结束后，可用含乳酸、 吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)和氯化硝基四氮唑蓝(NBT)的染色液将区带染色，染色原理为：LD催化乳酸脱氢，脱下的氢由 PMS，由PMS传递给NBT，NBT还原为紫红色的化合物而使区带染色。染色后洗脱支持介质背景染料，用光密度扫描仪扫描区带，或将区带切下洗脱比色测定。
电泳法简便、快速、分离效果良好，并且一般不会破坏酶的天然状态，是研究同工酶最为广泛的方法。电泳分离后区带显色是电泳法分析的关键步骤之一。图5—3为琼脂糖凝胶电泳分离的血清LD同工酶谱。
用电泳法进行同工酶分析时，如显示的区带数与同工酶数不一致时，要特别注意巨分子酶的存在。巨分子酶形成的原因主要有：①酶与免疫球蛋白形成的复合物，如CK-BB一IgGCK—MM一IgA、LD—IgA等；②酶与其他蛋白质形成的复合物，如LD—B．脂蛋白等；
⑧酶亚基或酶分子之间形成的聚合物，如CK．Mt聚合物、LD亚基自身聚合等。现已有关于CK、LD、AsT、AMY、一GT和ALP等巨分子酶的报道。例如，将可疑血清进行琼脂糖凝胶电泳结合荧光染色扫描分析，发现巨CK。位于CK—MM与CK．MB之间，巨CK，位于CK—MM的阴极侧(图5—4)。
另外，尚有免疫学结合电泳法，如将可疑血清先与抗人IgG或IgA的抗血清进行混合，置4℃过夜，离心取上清液进行CK同工酶电泳。
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