【求助】奇怪的PCR结果

字体: 小中大 | 打印发表于: 2014-9-24 10:55 作者: toy 来源: 分析测试百科网

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【求助】奇怪的PCR结果

我按照在NCBI上查找的目的蛋白序列，然后设计引物（加入的有保护碱基的），然后以基因组DNA为模板用pfu酶进行pcr结果是单一条带，但是测序返回的结果和我查的序列完全不匹配。我在文献查找的这个蛋白的引物，然后PCR有多条杂带，求高手！

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glass (2014-9-24 10:56:27)

即使单一条带，测序结果为非目标序列，那说明引物特异性还是不好。文献中的引物扩增结果有杂带，但是关键看有没有大小符合你要的目标带，如果有，胶回收目标带测序鉴定。还有，你用基因组做模板，为什么引物要加保护碱基？是酶切位点的保护碱基吗？基因组做模板本来就容易非特异扩增，引物加了酶切位点和保护碱基会增加非特异结合概率，降低扩增效率，建议用常规引物扩出目标带，胶回收连到T载上后，以T载为模板，再用加了酶切位点保护碱基的引物去扩。
toy (2014-9-24 10:56:53)

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原帖由 glass 于 2014-9-24 10:56 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
即使单一条带，测序结果为非目标序列，那说明引物特异性还是不好。文献中的引物扩增结果有杂带，但是关键看有没有大小符合你要的目标带，如果有，胶回收目标带测序鉴定。还有，你用基因组做模板，为什么引物要加保护碱基？是酶切位点 ...
加的是酶切位点的保护碱基，同时文献报道的引物在它所提到的碱基大小根本就没有条带。
glass (2014-9-24 10:59:12)

改变扩增条件试一下，可以试下降落PCR。再不行那就重新设计引物，设计好后用NCBI的BLAST检查下引物的特异性。还有为什么不用mRNA反转录成cDNA做模板扩？
toy (2014-9-24 10:59:40)

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改变扩增条件试一下，可以试下降落PCR。再不行那就重新设计引物，设计好后用NCBI的BLAST检查下引物的特异性。还有为什么不用mRNA反转录成cDNA做模板扩？ ...
这是我带的一个本科生毕业论文还要做逆转录，老板没那么多钱烧。
glass (2014-9-24 11:00:08)

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原帖由 toy 于 2014-9-24 10:59 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

这是我带的一个本科生毕业论文还要做逆转录，老板没那么多钱烧。
那就改变条件再扩，其实，这样折腾未必就比做反转录省钱。
toy (2014-9-24 11:00:29)

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原帖由 glass 于 2014-9-24 11:00 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

那就改变条件再扩，其实，这样折腾未必就比做反转录省钱。

其实也有可能是测序结果有问题，因为当初我在上海生工测序，发给我的序列就是一个比对不成功的序列，当时他说测序失败。而且如果是特异性低的话在NCBI上应该有匹配，但是在NCBI上它跟什么都没有匹配性。
glass (2014-9-24 11:03:53)

测序结果有问题的可能性还是比较小的。你自己的引物扩出的片段大小要是对的话，那就回收后连到载体上多送几个样测序。
toy (2014-9-24 11:04:48)

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原帖由 glass 于 2014-9-24 11:03 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
测序结果有问题的可能性还是比较小的。你自己的引物扩出的片段大小要是对的话，那就回收后连到载体上多送几个样测序。
我现在也是这么做的，已经通过双酶切连接到表达载体上了，利用质粒来测序看看