【求助】引物的Tm值设计有上限吗？

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• wu11998866 (2014-9-25 11:08:30)

  
  我做过退火稳定为72度的PCR，退火延伸一起做了，所以TM直高于72度是可以的，但是由于TM过高，同时导致PCR特异性降低。
  还有当TM值低于72度时，PCR也能做的出来，我试过无数次了，至于你是72度是DNA双连熔开，我是这样认为的，DNA变性其实是一个突变的过程，这个突变温度是大于TM值的，当稳定缓慢升高到TM附近时，链是并没有打开。

• kswl870 (2014-9-25 11:08:47)

  我的理解是：很多Taq酶的最佳反应温度（不一定是最适温度）为72℃，超过会影响酶活，再者就是Tm值太高会影响有效退火，同时较高的Tm值一般也意味着引物较长（当然可能是GC含量高，但GC含量高更增加扩增难度），一来增加成本，二来又不一定能够增加特异性。

• kswl870 (2014-9-25 11:09:04)

  
  另外一个就是先区分一下Tm的定义：
  1、对于引物的Tm值，指的是50%的引物分子和其互补序列表现为双链时的温度，所以PCR时的退火温度一般都要比Tm值低5℃左右以确保有效退火；
  2、对于核酸分子的Tm值，指的是分子内部50%的双螺旋结构被打开时的温度。
  

• mingming0638 (2014-9-25 11:09:22)

  引物是一小段的DNA或者RNA，你的意思是说，小段的核酸与核酸是两个不同的概念还是别的意思？请多多指教
  

• kswl870 (2014-9-25 11:09:42)

  概念实质上是相同的，就看怎么理解这个“50%的引物”

• 四福晋 (2014-9-25 11:17:11)

  有没有相关的文献可以参考一下，本人是菜鸟，不过对这个问题很想了解得更加深入。

• ladyhuahua (2014-9-25 11:17:34)

  退火温度是让引物与单链DNA结合形成双链的一个适合温度吧，在形成双链之后再到72°来延伸。变性是使双链DNA变成单链的DNA，这个温度是94°，所以你延伸的72°是不会使双链解开的。
  

• yyaxw84 (2014-9-25 11:18:13)

  对，说得有理。参考下书本就知道啦，看啦还得返回书本啊

• 四福晋 (2014-9-25 11:18:40)

  核酸Tm值是解50%双螺旋时的温度，你的意思是该温度只是破坏了它的三级结构，但双链没有熔开；但对引物而言，会有50%的与模板分离，是这样吧。
      如果是引物会与模板分离，那么当温度上升到延伸72度时，会有引物与模板分开吧，我想是否是因为Taq酶此时已经与之结合，从而不会使已经结合的引物从模板上分离下来。
      个人感觉引物的Tm值对实验影响不大，做过近80度的（加上酶切位点保护碱基），也有40度扩增良好的。各个软件对Tm值的预测似乎相差也比较大，不知道为什么在设计引物时大家都这么强调Tm值？

• kswl870 (2014-9-25 11:19:08)

  本本总归是本本，不能死扣。
  
         关于引物Tm的那个50%，不可能指的是50%的引物分子，因为在PCR体系中引物分子的数目要远远高于模板链的数目，这样子引物才能比模板链的互补链更有效地和模板链发生碰撞，搭上模板链；只能理解成一个引物分子的一半碱基序列吧，这样子和核算分子解链温度（Tm）值实质上就是一致的了。
  
         至于像引入酶切位点的，我觉得计算引物Tm值时不能把那些不与模板链互补的碱基序列计算在内；
  
         引物的Tm值有很多种算法，而且其数值还和PCR体系里的离子浓度有关，各个软件所采用的算法、所默认的PCR盐离子浓度不同，当然计算出来的就有所差别，总之Tm值只是作为一个参考，没必要太死扣，也不能全然不顾。

• wood533 (2014-9-25 11:19:20)

  个人同意不要太计较Tm值

• 3648755 (2014-9-25 11:19:40)

  
  没上线吧，但是不能太高